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(無題) 削除/引用 No.3152-7 - 2010/09/07 (火) 02:27:37 - おお 質問が曖昧ですよね。 ビオチン化BSAは手元にあるんですか、作らないといけないのですか?。 手元にあるならPBSなどに溶解してブロットするだけなので、何処に困っているのかよくわかりません。 ドットブロットようの装置があるならそのインストラクションに従えばできると思いますし、各社のドット、スロットブロッターのトリ説などみると、丁寧な解説が載ったものもあったとおもいますし、複数調べることで、一つではよくわからないところもカバーできるはずです。 カレントプロトコールとかもたぶんきっちりとしたプロとコールを提供してると思いますし一度そう言うのを調べたらどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3152-6 - 2010/09/06 (月) 17:45:41 - ats orz...　（濃度は単位ないし...） ドットブロッターやスロットブロッターと呼ばれる機器を使うと、スポットの大きさを揃えられます。基本的には膜を決まった大きさの穴が空いた器具に挟み、吸引する装置です。 （誰でも思いつく）簡便法として行っている方法を紹介します。もっと上手な方法はあるとは思います。 手作業で行うとスポットの大きさが変わってしまうのが難点ですが、検出が発光など定量しやすいものはそこそこうまく行きます。 (1)溶液は、2~5uLに揃える（全部2uLとか）。濃過ぎると結合容量超過となります。 10uLだとスポットが大きくなります。 (2)鉛筆などでスポット位置をマーキングする（実際にスポットするのはマークの無いところ）。 最低でも5mmほどは離した方がよいです。 (3)PVDF膜ならメタノールで親水性処理を行い、PBSなどに置換する。 (4)ペーパータオルで軽く挟んで余分なPBSを吸い取り（吸い取りすぎるとダメ）、新しいペーパータオルの上に置く。 (5)素早く（白く乾かないうちに）、一定量をP2ピペットマンでスポットしていく。 数が多い場合は、8連ピペットを利用する。 (6)スポットした溶液がしみ込んだらblockingを行なう。なお、膜が一部乾いたら、PBS-0.05%tween20などで湿らせて（白い部分が無くなって）から行なう。 実験目的に合えばよいけど。

修正 削除/引用 No.3152-5 - 2010/09/06 (月) 16:09:54 - TM 基礎的な質問かもしれませんが教えてください。 今、実験でPVDFかニトロセルロースのメンブレンシートに濃度の違う(1×10^-2〜3.0×10^-6ぐらい)のビオチン標識のウシ血清アルブミンをブロットして、アビジンを反応させる実験を行わなければなりません。 そこで、このようなサンプルはどのように作成したら、いいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3152-3 - 2010/09/06 (月) 15:38:18 - ats 何のための実験かわかりませんが、以下の理由で成功しないと思われます（目的次第ですがもっとよい方法があると思います）。 ビオチンは低分子化合物であるため、(1)PDVF膜への親和性が低く、アビジンが結合したとしても、その後の洗浄過程ではがれる。(2) ビオチンのアビジンとの結合はアビジンのポケット構造にはまりこむように結合すること、ビオチンは平面的に膜上に結合すると思われるので、そのようなビオチンはアビジンのポケット構造には結合できない。 これらを回避するには、リンカーがついたビオチン分子を膜に固定すればよいかと思います。官応基がついたビオチン分子が「ビオチン化剤」として各種販売されていますので、実験目的によって選べばよいでしょう。

ドットブロットについて 削除/引用 No.3152-1 - 2010/09/06 (月) 15:17:23 - TM 基礎的な質問かもしれませんが教えてください。 今、実験でPVDFかニトロセルロースのメンブレンシートに濃度の違う(1×10^-2〜3.0×10^-6ぐらい)のビオチンをブロットして、アビジンを反応させる実験を行わなければなりません。 そこで、このようなサンプルはどのように作成したら、いいのでしょうか？

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