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(無題) 削除/引用 No.3149-11 - 2010/09/08 (水) 04:51:01 - b 理解しました。 伸長の温度ですね。 お騒がせしました。

(無題) 削除/引用 No.3149-10 - 2010/09/08 (水) 00:08:27 - b > nnnさんの「できない」は、 > ＞私の所属している研究室にTOYOBOが販売している「KOD -Plus-」という酵素があるのですが、この酵素を使用してインサートDNAの平滑化は可能でしょうか？ > じゃ無くって、 > ＞また、可能であるならKOD -Plus-と付属のバッファ、dNTPsとインサートDNAを混合し、72℃で10程度反応させればよろしいのでしょうか？ > の返事と思います。 > 説明書をよく読んでください。 参考のために教えて下さい。 最近KOD Plusを使っていないので手元に説明書がないのですが、72度で反応させるだけで平滑化ができないというのは、抗体の失活以外の理由が説明書に書かれているのでしょうか？ KOD Plusに添加されている2種の抗体は、室温から50度付近での活性を阻害するためで、70度くらいから抗体の失活がおこり、結果的に酵素の活性化が起こります。 72度では抗体の失活が起こり始めるので、72度での反応でも平滑化は可能だと思うのですが。 それとも、日本語のなぞかけか何かでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3149-9 - 2010/09/06 (月) 14:34:00 - ~ Proof-reading活性がどの位悪さをするか次第ですが結果としてはできますよね。 それよりも、値段の高い耐熱性ポリメラーゼをその使用目的で使っていいかの方が問題だと思います。 ラボ内にあれば、半額くらいで済むKlenow fragmentやT4 DNA Polymeraseの方が第一候補になるでしょう。 細かい教員や先輩がいるラボだと、無駄使いだと怒られてしまいますので、 ”出来るかどうか”ではなく”やっていいか”についてラボ内で確認をしたほうがいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3149-7 - 2010/09/06 (月) 08:11:39 - Actias 出っ張りを削りたいのではなく、 引っ込みを埋めたいのですよね？ nnnさんの「できない」は、 ＞私の所属している研究室にTOYOBOが販売している「KOD -Plus-」という酵素があるのですが、この酵素を使用してインサートDNAの平滑化は可能でしょうか？ じゃ無くって、 ＞また、可能であるならKOD -Plus-と付属のバッファ、dNTPsとインサートDNAを混合し、72℃で10程度反応させればよろしいのでしょうか？ の返事と思います。 説明書をよく読んでください。

(無題) 削除/引用 No.3149-5 - 2010/09/06 (月) 07:19:07 - b 文字化けしてしまいました。 "ºC"はすべて、"セルシウス度"です。

(無題) 削除/引用 No.3149-4 - 2010/09/06 (月) 07:16:24 - b 昔、KOD Plusで平滑化を行っていましたが、DNA以外を混ぜたものを95ºCで5分incubationして、少し冷めてからDNAをいれて、72ºCで反応させていました。 ただ、タンパク質の変性という観点から考えると、70ºC以上から変性するようなので、72ºCで反応させるだけでも酵素の活性化は起こり得ます。 http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/lifescience/tech/upload/upld73/hotitem/specialrea73hi01.pdf 72ºCで1 stepで反応させる場合は、念のため30分位反応させてみると十分かと思いますが、面倒でなければあらかじめ変性させるか、平滑化用の試薬やキットを使った方が無難でしょう。

(無題) 削除/引用 No.3149-3 - 2010/09/05 (日) 22:21:13 - nnn 結果から言うと、（単に混ぜて７２度の反応では）平滑化は出来ないです。 原因は、 KOD -Plus-に入っているKOD DNA Polymeraseと、 同じTOYOBO社のBlunting highに入っているKOD DNA Polymeraseの 状態の違いから、考えてみてください。 従って、ひと手間かけると出来るようになるのかもしれませんが。 （私は試したことはないですが） まあ、Pfuなどの3'→5' exonuclease活性を持つDNA polymeraseを使っての 平滑化っていうのは以前からあるプロトコールです。

(無題) 削除/引用 No.3149-2 - 2010/09/05 (日) 16:17:22 - a 説明書を読めば書いてあることを質問するのはいかがなものかと

平滑末端化について 削除/引用 No.3149-1 - 2010/09/05 (日) 16:08:46 - 初心者学生 大学４年生でベクター作成をしています。 Sal Iのみで切り出したインサートDNAを平滑末端にし、Nru Iで処理したベクターにライゲーションしたいと考えています。 この平滑化について質問させて頂きます。 私の所属している研究室にTOYOBOが販売している「KOD -Plus-」という酵素があるのですが、この酵素を使用してインサートDNAの平滑化は可能でしょうか？ また、可能であるならKOD -Plus-と付属のバッファ、dNTPsとインサートDNAを混合し、72℃で10程度反応させればよろしいのでしょうか？ ご教授よろしくお願いします。

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