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(無題) 削除/引用 No.3147-13 - 2010/09/08 (水) 13:12:20 - おお メチルかヒストン特異的抗体によるIPは結構文献が出ていると思いますからお探しになってみてはどうでしょうか? 絶対に阻害剤がいるものとも限らないでしょうから。

(無題) 削除/引用 No.3147-12 - 2010/09/08 (水) 12:09:56 - ChIP初心者 すいません。Na-butyrateはヒストン脱アセチル化酵素阻害剤でした。私はヒストンのメチル化を見るので、ヒストン脱メチル化酵素阻害剤を入れないといけないようですが、一般的なのはまだ見つけていません。

(無題) 削除/引用 No.3147-11 - 2010/09/08 (水) 09:05:00 - ChIP初心者 おお様 ありがとうございます。以前より、多くのトピックで、書かれたおお様のコメントをご参考にさせてもらっています。 Nature Protocolに掲載された（VOL.3 NO.6 P1032-1045 2008)少量の細胞を用いるChIPでは新鮮組織、凍結組織および培養細胞でできるプロトコールがありました。ここでは培養細胞を固定後グリシンで中和、PBS/Na-butyrateで洗いペレットを凍結保存可能と書かれていました。ただPBSに酪酸ナトリウムを加えている点が、使う予定の"SIGMA ImprintÒ Chromatin Immunoprecipitation Kit"と異なりますので、SIGMAに聞いている最中です。 また凍結組織が使えるのであれば、凍結細胞も同様に使えるのではないかと言う疑問もあり、迷っています。実はこの実験では同一処理した細胞ををRNA用とChIP用に分け、RNAを用いて複数の遺伝子発現をリアルタイムPCRで調べることも行ない、RNAの実験結果を踏まえてChIPを行なう流れになっています。RNA量はある程度予測できますが、今までの実験でも余裕があった訳でもないので、RNA不足に陥った場合に小分け凍結したChIP用の細胞をRNA用に回せれば私にとっては都合が良いのです。またリアルタイムPCRの結果次第では蛋白を抽出してウエスタンをしようとも思っており、凍結細胞から抽出することも考えています。もちろんChIP用の保存法として問題があるのならば、蛋白用に凍結細胞を分けて保存することになります。 時間かお金に余裕があれば、細胞を取るマウスの数を増やす、一部実験を次回の実験で行なうと手段もあるのですが、これが最後の動物実験になりそうなので、詰め込むような内容になりました。

(無題) 削除/引用 No.3147-9 - 2010/09/08 (水) 04:19:16 - おお 以外と厳密にサゲスチョンもらったラボから、その厳密せいはあまりないとか、、、そう言うのがあってやはりやってみないとわからないところも多いと思いますし、ターゲットによって難易度も大きく変わるアッセイ と思いますのでコメントしにくいとおもいます。 プロとコールを教えてくれたラボは、組織を取って固定後核を調製(といっても固定されているので厳密にサイトゾルの蛋白をわけることは不可能と思いますが)後凍結して保存できるといってました。 ただうちのラボのせっかちが組織とっては凍結して使えと無責任なことをいうので、もう一度組織をとって凍結してしまうと細胞自体壊れてしまうのでどうでしょうときいたところ、今のとことそれでやっていて問題ないといいます。最初のプロとコールはなんだったのかなぁって、、、 わたしなら固定してその後核の回収の操作がプロトコールにあるならそこまではすると思います。 まあ当てにならない意見とぐらいにとってください。保証できませんから。 ネイチャープロトコールとかみました? 近い実験をしているラボに直接きいてみてもいいかもしれませんよ。

(無題) 削除/引用 No.3147-8 - 2010/09/08 (水) 03:15:56 - ChIP初心者 あかね様 申し訳ありません。間違えていました。中和は1.25MGlysinを十分の一添加して行い。PBS洗浄はその後3回行なう予定です。ホルマリン固定後ここまでやって凍結すればよいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3147-7 - 2010/09/07 (火) 11:10:39 - ChIP初心者 あかね様 ありがとうございます。凍結の際、ホルマリンが残っていると過剰固定されるかもしれないので、PBSで1回又は数回洗浄したほうが良いでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3147-6 - 2010/09/07 (火) 02:24:41 - あかね 細胞を固定して、遠心し、細胞のペレットを-20℃で保存すれば問題ないです。

(無題) 削除/引用 No.3147-5 - 2010/09/07 (火) 02:20:46 - ChIP初心者 紫蘇様、GE様、Actias様　ありがとうございます。 紫蘇様 初代培養のリンパ球を数日間培養して実験に用います。 GE様 対象細胞数が少なめのキットを2つ検討しています。凍結に関してはどちらも記述がありませんでした。 Actias様 そうしたいのはやまやまなのですが、この実験がいまいるラボの最後の実験になります。ラボ閉鎖まで時間もお金もなく、みな少しおかしくなっていて、実験開始を待ってはくれません。 現在の考えは、全ステップの細胞を液体窒素で凍結しLN2フリーザに入れて、試薬が来たら実験の最適化を行ない、条件決定後、凍結の影響を同一細胞で調べ、凍結の影響が出た場合は、あきらめようと思っています。

(無題) 削除/引用 No.3147-4 - 2010/09/06 (月) 08:20:27 - Actias ぼくなら、DNA抽出までは一気にやる。 ということは、トピ主さんの場合、試薬がそろうまであきらめる、ということ。 ホルマリン固定からソニケーション辺りまでは、やってもいいかもしれないが、（現在、どのくらいまで再現性が出る実験技術になったか分かりませんが)結果が不安定な検出技術なので、コントロール実験まできっちりと計画を立ててから実行することをお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.3147-3 - 2010/09/05 (日) 10:59:49 - GE クロマチン免疫沈降のキットが各試薬メーカーから出ていると思います。そのマニュアルに載っていると思いますので、一度見てみては？文献よりも参考になると思います。

(無題) 削除/引用 No.3147-2 - 2010/09/05 (日) 08:16:59 - 紫蘇 私は答えることができませんが、もう少し詳細を書かれたほうがよいかと思います。 例えばどのような細胞（付着、浮遊）とか。今ある試薬でどこのステップまでできるのかとか。

クロマチン免疫沈降用の細胞保存法 削除/引用 No.3147-1 - 2010/09/05 (日) 06:40:11 - ChIP初心者 いつも勉強させてもらっています。 最近得られた実験データからクロマチン免疫沈降を行わなければいけなくなりました。うちのラボは過去1回も行ったことがないため、試薬や抗体を注文し出来れば予備実験もおこないたいと考えています。しかしうちのラボは分業制で、次の実験は既に始まっており、細胞を採取する日に試薬が間に合いそうにありません。ボスは分子生物学に暗い人なので、文献が頼りなのですが、検索方法が悪いのか凍結組織の論文しか見つけられませんでした。 どのようにしたら、細胞を免疫沈降用に保存できるのか教えて下さい。文献名など教えていただくと、より助かります。

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