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リンパ球の増殖アッセイ トピック削除
No.3143-TOPIC - 2010/09/03 (金) 22:53:16 - CIA
よろしくお願いします。
リンパ球の増殖assayについて教えてください。
collagen-induced arthritisの実験において、リンパ節細胞の増殖アッセイを行おうと思っています。
一般的に行われているプロトコールでは、
@鼡径リンパ節を摘出し、ストレイナーに通して、2-MEをいれたRPMI培地で細胞浮遊液を作成し、1x10^6/200μLで96wellにseed。
A48-72時間培養し、上清100μLはサイトカイン測定用に回収。
B残った培地100μL＋細胞にthymidineを加え、16-18時間後に測定
となっています。

これを行うにあたって、うちの施設の問題として、RIが使えません。
代わりの増殖assayとして、Formazanを利用したMTS assayをやってみましたが、おそらく培地中の2-MEのためにバックグラウンドが非常に高くなり、うまく測定ができません。

thymidine assay以外で、2-MEが存在する条件下で、リンパ球の増殖assayを行う方法はありますでしょうか。
もしくは、2-MEを培地に加えずに細胞を培養して、サイトカインを測定したり、MTS assayを行うことは可能でしょうか。(2-ME無しだとリンパ球の増殖に影響が出てしまい、妥当な結果が得られないだろうな、とは重々予想していますが、、、)

※「リンパ球の増殖アッセイ」ではなく、正しくは「リンパ球分画を多く含んだ全リンパ節細胞の増殖アッセイ」ですが、そこは突っ込まないでください。
　
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(無題) 削除/引用
No.3143-6 - 2010/09/04 (土) 22:02:06 - CIA
>ami様

過去の掲示板で
http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;Code=2537
2-MEの役割として、
「ある種の細胞は、細胞内のグルタチオンに含まれるシステインを培養液から取り込むのですが、このとき還元型システインでないと取り込まれません。ただしシステインは非常に酸化されやすいため2MEなどの還元剤を培養液中に添加してやらないと取り込みが悪くなり、結果的に細胞内中のグルタチオン濃度が減ります。」
との記載があるのですが、amiさんのコメントとあわせると、「新しい培地ならシステシンがあまり酸化されていないので、2-ME無しでも還元型システインがリンパ球を維持できるほど十分に含まれている」という理解でよろしいでしょうか？

＞DC様
コメントありがとうございます。
WST8は過去に別の細胞で使ったことがありますが、非常に操作は簡便で、(他とは比較してないですが)感度もよかったです。
今回、WST8を使おうとボスに購入をお願いしたら、ボスの手持ちのMST assay試薬を渡されました。（若干使用期限の切れたものを、、、）
ただ、WST8も原理的には2-MEの影響を受けそうです。

>ami様、DC様
CFSEという手法もあるのですね。勉強不足で知りませんでした。
FACSをすぐに使える環境にはないので、今後の検討課題とさせて下さい。

(無題) 削除/引用
No.3143-5 - 2010/09/04 (土) 15:18:00 - DC
WST8もそれなりに感度があっていいと聞きます。
CFSEは染色の腕がそれなりに問われると言われますが、分裂回数を数えたりするのでなければ問題ないでしょう。

in vitro刺激なら 削除/引用
No.3143-4 - 2010/09/03 (金) 23:50:45 - ami
増殖する細胞の割合が多いならCFSE、少ないならBrdUおすすめ。

ありがとうございます 削除/引用
No.3143-3 - 2010/09/03 (金) 23:41:33 - CIA
ありがとうございます。
2-ME無しでもリンパ球を維持できるのですね。
2-MEは必須かと思ってました。

説明が足りなかったですが、
そのリンパ節細胞を、無刺激の場合と、(関節炎誘導に用いた）typeU collagenで刺激した場合で、サイトカイン産生、増殖を比較する予定です。

次にやるときは、2-MEを入れない培地（RPMI＋10%FBS＋ペニシリン/ストレプトマイシン）でサイトカイン測定、増殖アッセイを試みてみます。
増殖アッセイは手元にあるMTS assayをやってみます。

(無題) 削除/引用
No.3143-2 - 2010/09/03 (金) 23:22:03 - ami
(1) 2-MEなしでも、新しい培地ならちゃんと増えます。

(2) CFSEか、BrdUとか。

よく知らない実験系だけど、刺激なしでも増えるのかなぁ･･･。

リンパ球の増殖アッセイ 削除/引用
No.3143-1 - 2010/09/03 (金) 22:53:16 - CIA
よろしくお願いします。
リンパ球の増殖assayについて教えてください。
collagen-induced arthritisの実験において、リンパ節細胞の増殖アッセイを行おうと思っています。
一般的に行われているプロトコールでは、
@鼡径リンパ節を摘出し、ストレイナーに通して、2-MEをいれたRPMI培地で細胞浮遊液を作成し、1x10^6/200μLで96wellにseed。
A48-72時間培養し、上清100μLはサイトカイン測定用に回収。
B残った培地100μL＋細胞にthymidineを加え、16-18時間後に測定
となっています。

これを行うにあたって、うちの施設の問題として、RIが使えません。
代わりの増殖assayとして、Formazanを利用したMTS assayをやってみましたが、おそらく培地中の2-MEのためにバックグラウンドが非常に高くなり、うまく測定ができません。

thymidine assay以外で、2-MEが存在する条件下で、リンパ球の増殖assayを行う方法はありますでしょうか。
もしくは、2-MEを培地に加えずに細胞を培養して、サイトカインを測定したり、MTS assayを行うことは可能でしょうか。(2-ME無しだとリンパ球の増殖に影響が出てしまい、妥当な結果が得られないだろうな、とは重々予想していますが、、、)

※「リンパ球の増殖アッセイ」ではなく、正しくは「リンパ球分画を多く含んだ全リンパ節細胞の増殖アッセイ」ですが、そこは突っ込まないでください。
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