全17件 ( 1 〜 17 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.3137-18 - 2010/09/08 (水) 03:44:46 - おお 一度お使いのプラスミドにニックがどのていど入っているか確認しておいた方がいいかもしれません。 ニックがあると、パーシャルな長さのものがでたいりという可能性は高くなるだとうと予想はできますので。 基本的なところなので余計なおせっかいかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.3137-17 - 2010/09/05 (日) 16:46:05 - み 大きなサイズの蛋白のstableを作る際には多々見受けられることと思います。 限定分解（プロテアーゼ）の可能性を主張したいなら、最低限、同じ細胞でのtransientでも低分子化されたものが見え、且つendogenousなものもその細胞で同じサイズのバンドが観察されることを示せば良いでしょう。 transientでは導入効率が悪いとか言い訳されてますが、GFP抗体でIPでもすれば余裕で検出できるのでは？

(無題) 削除/引用 No.3137-16 - 2010/09/05 (日) 11:11:20 - おお 知り合いがシングルクローンをいくらか拾って 調べたけどstableで目的の遺伝子は100kDaくらいなのに30そこそこに出てくるというのを経験しています。 トランジェントで同じ細胞でやると、エンド+タグのサイズあたりに出てきます。実際シングルでコロニーを見ていっても、gfpタグでちゃんと光っているのは確か殆どなかったみたいです。 エンドが実際ほぼフルの長さで発現していることからプロテアーゼによる分解などはあまり考えませんでした。どう時にその細胞でエンドで顕著に小さい分子が見れるわけでもありませんでした。実際にグロースにかなりネガティブに働く遺伝子でした。もし細胞に悪いことをしているならば、発現により増殖にネガティブに働いている可能性が高いですし、ネガティブに働いているならば、ちゃんとした発現ユニットが働かず(都合がわるく、メチレーションされたりとか)、インテグレーションのときフラグメント化したものから発現している可能性も高いです。あるいはインテグレーション後に部分的にキックアウトされたとか。 ただしそれでもスペキュレーションの域を超えません。 あとはcmvは強力なのでメチレーションの対象になりやすりので、もっと弱いものを選ぶとかいろいろなやり方が一時は手探りされていましたが、やはり都合の悪いものは都合が悪いわけで、、、そうすっきりとした解決方法が 見つかったかといわれればそれはどうかなぁと、、、 そう言う意味ではエンドのプロモーターが一番生理的に近くいいのではないかという意見もあるにはあります。 皆さんの指摘にもバリエーションがありますように、結論は急がない、あるいはそれだけでは出ないと思います。プロテアーゼの可能性も面白いと思いますし、あなたの目的に沿った系を考えながらそう言うのが見れるかかんがえて見るといいかと思います。 誘導型のプロモーターを使うのは手だと思います。クローンを拾うとき、あなたの遺伝子による細胞の負担がかかりませんので。実際に増殖にネガテイィブに働くのでと誘導型を使った例はけっこうあると思います。 ただ、発現しにくい細胞である可能性はありますのでそれをもって何をするかとか次第ではないでしょうか。 スプライシングがアクシデンタルに起こっている可能性はcDNAであれば殆どないと思えますが、これも決定的に否定できるものでもありません。 gfpに関してはそれ自身の毒性を指摘する人がいますが、それも安定でバンバンに発現するのが一つの原因のようです。一つあり得るとするとタグの位置で生理的おこる制御などが一部正常に行われないかもしれません。ただそれでそこまで極端なことがお起こるだろうかといわれれば、よくわかりません。 発現の目的について触れていませんので(触れたくはないのかもしれませんので特に書けとは申し上げませんが)、具体的なサジェスチョンはできませんが、皆さんのコメントを考慮して、ご自分の実験に合った系ができるといいですね。

(無題) 削除/引用 No.3137-15 - 2010/09/04 (土) 17:25:42 - stu 私は安定発現株をよく作っておりますが（レトロウイルス系で）、コンストラクトがおかしい以外でそのような経験はありません。 そのことから、半プロさんや通りすがりさんがすでに述べているように proteaseによるcleavageに一票です。 反対側にGFPタグをつけても同じような現象、でも違うサイズになるのならその線が濃いと思います。 WBからそのGFPと小さくなった目的産物の大きさサイズが予想できるので、実際にその切れたと考えられる箇所付近にprotease cleavage siteがあるかどうか、適当なwebソフトで検索してみては。 私は詳しく知りませんが、「protease cleavage site search」でググレばサイトはありそうですけど。

(無題) 削除/引用 No.3137-14 - 2010/09/04 (土) 15:07:05 - モモ Stable clone の作り方としては、transfectionしたら、その日のうちか遅くても翌日にはプレートにまいて、それからselectionをかけるほうがよいと思います。バルクの状態でselectionをしてしまうと、grouthの早いクローンが増えてしまうので、そのあとプレートにまいても欲しいクローンをとるのが難しい場合が出てくると思います。

(無題) 削除/引用 No.3137-13 - 2010/09/03 (金) 22:34:00 - 半プロ その細胞にはsite specificに切るようなproteinaseがあるのかもしれない。293細胞などではそういうものははないから、それはそれで面白い発見かもという気もする。移動度と分子量の関係や抗体の認識部位のこと、切れ方はエンドでバシッと切れたかエキソでバラバラか、場所は一カ所かマルチプルなど慎重な検討は必要だけど、分子量情報とGFPどっち側に付けたかわかればだいたいこの辺にカットはいったかなと予想できるかな。 それか、無理に過剰発現させた変な蛋白質は分解系の標的にされたりとか、HSCとかもいろいろくっ付く（昔、intaractome調べたら実際そういうのがいっぱいついてた）からGFP部分を含むそのくっ付いてるとこだけproteinaseから保護されてそれ以外の露出してるとこがバラバラにこわされたのかもしれない。だとすると細胞にとってこれは壊すべき変なコンフォメーションと認識されたのかもしれない。だと、やっぱその細胞にはその融合蛋白質は合わないという事かもしれないから細胞変えた方がいいかもというかうまくいってる293じゃだめですかね。 あと細胞破砕や蛋白質抽出とかの時に分泌型メタロプロテアーゼが活性化して何か悪さしてないかな。がん細胞はMMPいっぱい産生してるやつ多いでしょ。EDTAとか入れてみたらどうかな。

(無題) 削除/引用 No.3137-12 - 2010/09/03 (金) 14:14:41 - ？ もうちょっと必要な情報を正確に提供していきましょうよ。 アドバイスする前に、突っ込みどころが満載です。

(無題) 削除/引用 No.3137-11 - 2010/09/03 (金) 13:01:17 - 通りがかり 不都合とか何とか言うより、単純にその細胞がＡに作用するプロテアーゼを発現していたというだけでは？ 別の可能性としては、mRNA がスプライシングを受ける場合もあります。 いずれにせよ、全長蛋白が欲しいなら細胞種を変える必要がありそうです。 あとは切断部位を同定して変異を入れるか。 > GFP sortingで、少数のGFP発現細胞を回収して、polyclonalな状態でGFP抗体でウェスタンをしました。 薬剤選択を行ったかどうかハッキリしませんが、Transfection １〜２日後に GFP を発現している細胞だけ集めてウェスタンしたのならそれは Transient での発現ですよ。

(無題) 削除/引用 No.3137-10 - 2010/09/03 (金) 12:46:20 - KMH コンストラクトは、作成後に１）シーケンスして変異が無いこと、２）２９３T細胞でTransient Transfecionして期待した大きさのGFP発現を確認しております。

(無題) 削除/引用 No.3137-9 - 2010/09/03 (金) 12:34:56 - TS 一応確認です。大前提ですので。 ＞Transient発現での蛋白発現サイズがどうかというのはできておりません。 293Tでは、ちゃんとした長さのものができているから、コンストラクトは問題ないのですよね？ ＞２９３Tにtransientに発現させた蛋白と比較してかなり小さいところ（GFPのみぐらいのサイズよりすこし大きい程度）にバンドが検出されてしまいました。（ベクターはｐEGFP-C1を使っています。）

(無題) 削除/引用 No.3137-7 - 2010/09/03 (金) 12:13:34 - う 一応、確認 遺伝子Aのコンストラクトのチェックは？ それこそ、自分が持っているコンストラクトによって発現するもののチェックを 自分で293なりHeLaなりで確認してみても良いのでは？

(無題) 削除/引用 No.3137-6 - 2010/09/03 (金) 12:07:00 - KMH たくさんご意見をいただきありがとうございます。 条件など情報不足の質問で申し訳ありません。 ある細胞に、遺伝子A,BとコントロールベクターのStableを作りました。 Transientの効率が、コントロールベクターで３０％程度で、目的遺伝子だと5％以下とかなり悪いためと（LipofectaminやFugene6およびamaxiaなどで効率改善を図りましたが、いまひとつでした。）、Stable作成を試みました。 GFP sortingで、少数のGFP発現細胞を回収して、polyclonalな状態でGFP抗体でウェスタンをしました。（蛍光顕微鏡で、GFPの発現自体は確認しました。） そのため、Transient発現での蛋白発現サイズがどうかというのはできておりません。 遺伝子B,コントロールのGFPのみのStableは、GFP発現も発現している蛋白の大きさも期待通りのものでしたが、遺伝子Aに関しては、最初に質問したとおりまったく異なったものでした。 そのため、もう一度やり直しましたが、同様の結果となりました。 その期待していない大きさのバンドの位置には、Nul、GFPコントロール、遺伝子B発現stable株でバンドがないので、Nonspecificのものではないと考えております。 また、蛍光顕微鏡でGFPの発現自体は確認できているので、期待サイズより小さいGFPfusion蛋白が発現している可能性を考えました。 ポリクローンで、そういう結果だったなので、蛋白が試みている細胞にとっては都合が悪いか何かの理由で、制御を受けているのかもしれないと考えたわけです。 その遺伝子AのStableは、論文上では２９３、Hela細胞で作成が報告されているので、現在試みている細胞では相性がわるいのかもしれません。あきらめて別の細胞株の実験に移るべきかとも考えましたが、こういう場合になにかいいトラブルシューティングを知っている方がおられないかと思い掲示板でお伺いしたし次第です。 ポリクローンのなかに、ごく少数期待した細胞が含まれている可能性は無いとはいえないので、クローニングして一つずつ発現サイズをチェックすべきなのかもしれないのですが、期待値があまり高くない気がして、躊躇しています。 ご意見よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.3137-5 - 2010/09/03 (金) 09:52:48 - TS いくつぐらいのクローンを取ってそうなったのでしょうか？ また、Selectionしてからクローニングしてると思うのですが、クローニングに入る前の細胞集団（ネガティブなものも含まれるとは思いますが、ポリクローンのような状態）でのWBは試されましたでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3137-4 - 2010/09/03 (金) 09:47:00 - み よくあることだと思います。 単にベクターがゲノムにインテグレーションする際にORFが分断される形になったのでは？

(無題) 削除/引用 No.3137-3 - 2010/09/03 (金) 08:23:00 - う 単純に、 変なものをクローニングした可能性。

(無題) 削除/引用 No.3137-2 - 2010/09/03 (金) 08:05:31 - Actias ＞これは、恒常的に発現させようとしている蛋白が細胞にとって不都合なため消化されてしまっているということでしょうか？ それは、それが分かるための実験をしないとダメです。 たった一つの現象から、理由を言い当てるのは困難です。 Stableを作った元の細胞にtransient発現させると、どうなりますか？ また、抗体で観察したバンドが、ホントウに見たいものである根拠を追求しましたか？ たとえば、発現させてない細胞のウエスタンブロットでは、そのバンドが見えないことを確認したかどうか。

stable lineで発現蛋白サイズがかなり変化してしまう。 削除/引用 No.3137-1 - 2010/09/03 (金) 03:47:34 - KMH お世話になります。 ある遺伝子を肺癌細胞株に発現させ、その影響を調べるために、Stableをつくりました。 GFP抗体でウェスタンブロットをして発現蛋白のサイズをチェックすると、２９３Tにtransientに発現させた蛋白と比較してかなり小さいところ（GFPのみぐらいのサイズよりすこし大きい程度）にバンドが検出されてしまいました。（ベクターはｐEGFP-C1を使っています。） これは、恒常的に発現させようとしている蛋白が細胞にとって不都合なため消化されてしまっているということでしょうか？ 同様のご経験があり、対処方法をご存知の方がおられたらご教授いただけませんでしょうか。 GFPが悪さをしている可能性を考慮して、FLAGタグベクターにのせかえるなども検討しております。 あるいは、on-offの切り替えができる形での導入を考慮すべきでしょうか。 よろしくお願いいたします。

全17件 ( 1 〜 17 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---