全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

ザンギさん 削除/引用 No.3120-12 - 2010/09/02 (木) 15:44:14 - mame ありがとうございます。 キーワードを教えていただけるとすごく調べやすくなります。 一度、この方針で少しやってみようと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3120-11 - 2010/09/02 (木) 15:01:10 - ザンギ keywordを散りばめながらかくと 近縁種の配列を収集してmultiple alignment ↓ 保存領域の選択 ↓ degenerated PCR primerの設計 ↓ PCRクローニング ゲノム解読以前に流行った手法ですので、GAPDHに限らずこの手法で遺伝子 をとった論文がいくつか見つかると思います。

Pumpkinさん 削除/引用 No.3120-10 - 2010/09/02 (木) 14:52:55 - mame ありがとうございます。 何度も質問申し訳ありません。 ＧＡＰＤＨのクローニングとはどうやって行うものなのでしょうか？ 分子生物学に着手し始めたばかりなので、少しアドバイスをいただけませんでしょうか？ よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.3120-8 - 2010/09/02 (木) 11:47:50 - Pumpkin ちなみに私の扱う生物種でもGAPDHをはじめほとんど登録されていないのでクローニングしましたよ。ただ、これらは非常に保存性が高いので比較的容易にクローニングできると思います。がんばってください。

Pumpkinさん 削除/引用 No.3120-7 - 2010/09/02 (木) 10:48:50 - mame ありがとうございます。 Housekeeping geneを同定している論文いくつか読んでみようと思います。 残念ながら、興味のある糸状菌でGAPDHの遺伝子配列はまだ公表されていませんでした。どこから手をつけるか考え中ですが、これだけでも一つの大仕事になりそうです。 ありがとうございました。

ありがとうございます。 削除/引用 No.3120-6 - 2010/09/02 (木) 10:45:31 - mame ザンギさん ありがとうございました。 自分の疑問がまっとうだとおっしゃっていただいてすごく気持ちが楽になりました。 他の遺伝子がどのような傾向があるか少し調べてみたいと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3120-5 - 2010/09/01 (水) 16:20:43 - Pumpkin >ハウスキーピングな遺伝子の発現レベルが一定であると証明されたことはなく、むしろある程度の幅で変化するものであると認識されています。 ザンギさんの回答をみて反省したのですが、私がいいたいのもここです。house keeping geneが必ず一定になるということが大事ではなく、変化が少なく内部標準として使えるかが重要です。 内部標準のhouse keeping geneについては過去に何回か議論になっているので参考にしてください。あなたの取り扱う菌種でこのような系がないのであれば、house keeping geneの選考についてだけでも論文のfigになります（もしちろん論旨が大事ですが）。過去、そのような論文もあるので参考にしてください。 私はあまりやられていない真菌を使っていますが、マイクロアレイから入ったので内部標準に使うhouse keeping geneを発現パターンから決められましたし、GAPDHが再現性よく使えたので幸運だったかもしれません。まずは、他の生物種で使われているような内部標準遺伝子から検討するのがいいと思います。アクチンやチューブリンなどの細胞骨格系は結構ふり幅が大きいことが知られています。GAPDHの方が最近好まれていますが、やはり最適かどうかを検討しなければなりません。2つ以上の内部標準遺伝子で校正するのも考えた方がいいかもしれません。 QPCRをやっている方で、内部標準遺伝子の検討をしないでやっている方って案外いるように思えますが、非常に重要なところなのでしっかり検討されることをお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.3120-4 - 2010/09/01 (水) 14:47:49 - ザンギ たぶん悩んでおられることは、至極まっとうなことだと思います。 転写産物量の測定は都合のよいデータを出して見せてるという側面もあります。 あえて混乱するようなことを書きますが、悩む時の参考にしてください。 １細胞内のトータルRNA量は一定ではありません。 トータルRNAに含まれるmRNAやリボソームRNAの量も変化しますが、通常は最大でも10倍程度です。真菌類の胞子などではもっと事情が異なるかもしれません。 そもそも細胞の大きさも一定ではありません。 ハウスキーピングな遺伝子の発現レベルが一定であると証明されたことはなく、 むしろある程度の幅で変化するものであると認識されています。 単核細胞生物であっても分裂時にはゲノムDNAのコピー数が変化します。 定量PCRであれば絶対コピー数が決められると教わったかもしてませんが、それ は試料液中に含まれるコピー数であって、もとの生物の細胞内にいくつかったか を決めるにはかなり綿密な実験が必要になります。 そんなわけで比較対象がすごく重要です。 トータルRNAあたりのコピー数が2試料間で変化することを示せればよいので あれば、それで十分でしょう。 それが数倍程度の変化率であれば、その遺伝子だけではなくて他の遺伝子が どうか調べる必要があるでしょうね。 その時に変化率の小さそうな遺伝子の候補としてハウスキーピング遺伝子を 候補にするのは悪くない選択と思います。

ありがとうございます。 削除/引用 No.3120-3 - 2010/09/01 (水) 14:41:38 - mame Pumpkin さん ありがとうございます。 まず、Housekeeping geneの同定からはじめないといけないんですね。 actinは一度見てみたんですが、培養条件によってCt値が大きく変化してしまいました。 Housekeeping geneの同定の仕方はあるのでしょうか？ まずはそこからはじめたいと思います。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3120-2 - 2010/09/01 (水) 13:19:50 - Pumpkin >Housekeeping geneはその菌体ではまだ明らかにはなっていません。 まずはそこからあなたが確定しないと、QPCRの系は動きませんよ。あなたの興味ある糸状菌でのQPCRの系が、既報にないとするならば、調べたいステージ間での発現が一定になる遺伝子を内部標準として確保しなければなりません。一般的に、GAPDH, Actin, Tublinなどの遺伝子配列からプライマーを設計して、調べるしかありません。それらの遺伝子の配列が登録されていなければ、クローニングから始めなければなりません。 >菌体からのＲＮＡ抽出効率は培養条件の関係より一定にするのは困難です。 RNAの抽出効率を調べるのは非常に難しいと思います。インタクトなRNAをどのステージからも確保することが重要かと思います。 >トータルＲＮＡに含まれるmRNAの量は常に一定なのでしょうか？ 違います。 >目的遺伝子の発現量ではなく、トータルＲＮＡ中のmRNAの量が変化し、それを観測しているということなのでしょうか？ ? >培養条件を変えた細胞間の遺伝子の発現量の差なのですが、どうすればよいかわかりません。 あなたが参考にしている論文ではどのような実験が行われ、どのような結果が得られ、どのような考察をえているのでしょうか。それを整理する必要があります。

real time PCRからわかること。 削除/引用 No.3120-1 - 2010/09/01 (水) 11:39:38 - mame 最近、real time PCRを用いて実験を行うようになったのですが、調べれば調べるほどよく分からなくなってしまって、どつぼにハマってしまいました。 質問は、リアルタイムＰＣＲからわかることは一体何なのかです。 現在、糸状菌からＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ量を一定にして逆転写を行って、リアルタイムＰＣＲで測定をしています。 Housekeeping geneはその菌体ではまだ明らかにはなっていません。 菌体からのＲＮＡ抽出効率は培養条件の関係より一定にするのは困難です。 そこで質問なのですが、リアルタイムＰＣＲを行ってわかるmRNAの発現量とは一体何なのでしょうか？ トータルＲＮＡに含まれるmRNAの量は常に一定なのでしょうか？ もしそうであれば、目的遺伝子の発現量は他の遺伝子との割合になるのかな？と考えるのですが。 もしそうでなければ、目的遺伝子の発現量ではなく、トータルＲＮＡ中のmRNAの量が変化し、それを観測しているということなのでしょうか？ 実際求めたいのは、培養条件を変えた細胞間の遺伝子の発現量の差なのですが、どうすればよいかわかりません。そこもアドバイスをいただければと思います。 よろしくお願いします。

全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---