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プロトコールよく読んでみて 削除/引用 No.3106-4 - 2010/08/30 (月) 17:50:53 - ema ＞QIAGENを用いていましたが、bioanalyzerで純度が非常に悪かったので(RIN5〜6程度)、Trizolに変更しました。 RINが悪いのはQiagenのせいではありません。 agilent社の4×44Kを使用しているならagilentが出しているプロトコールを良く読んでそのとおりにしてください。 Trizol等のプェノール試薬＋ RNAeasy等のカラム精製を推奨はきっぱり書いています。 RNAeasyのLysisBufferであるRLTは細胞や組織の溶解度が低いのでプェノール系でしっかり溶かして（量が多い.＝.種類が色々とれている）RNAのQualityをあげるためにカラムというのは必須です。 DNAse処理は必ずしてください。DNAのコンタミでベースラインがあがり分解しているようなAgilent2100電気泳動図になりRINが低く見積もられる事があります。

Re emaさんへ 削除/引用 No.3106-3 - 2010/08/30 (月) 15:26:47 - 初心者 ご連絡ありがとうございました。 アレイはagilent社の4×44Kを使用しています。サンプル調製はこれまでQIAGENを用いていましたが、bioanalyzerで純度が非常に悪かったので(RIN5〜6程度)、Trizolに変更しました。 別の実験でTrizolで取ったRNAで何の問題もなくラベル化まで行けていたので、QIAGENカラムを用いた再精製は行わなくてもよいかなと思ったのですが・・・。emaさんのご指摘通り一度カラムで再精製したサンプルを用いてラベル化を行ってみます。

アレイ用の基準 削除/引用 No.3106-2 - 2010/08/30 (月) 13:39:49 - ema アレイ用の精製基準があってないようなのですが。 アジレントやアフィメトリクス等の作成会社、受託をしている各社の基準に照らし合わせてもTrizolで止めているところはなく、Trizol等のプェノール試薬＋ RNAeasy等のカラム精製を推奨しているはずです。 標識には酵素反応がありますが、ここでプェノール等の夾雑物がはいっていると致命的になります。 アレイの標識ではなく、微量のRNAを増幅する場合でも（似たような酵素ステップで増幅していくので）Trizol精製で行うとほとんど増幅されず、全く同じサンプルをカラム精製を行うと大丈夫です。 核酸量が大量だと夾雑物の”比率”が薄くなりますが、希釈するとO.D.でも出てくると思います。 どこのアレイのプラットフォームをお使いか分かりませんが、旧時代の１−８ug標識開始の様なものだと少しは影響が少ないですが、近年の25ng〜とかの微量標識の試薬を使用した場合は基準値以下になると思います。

脾臓RNAの純度 削除/引用 No.3106-1 - 2010/08/28 (土) 09:43:53 - ああ いつもお世話になっております。 薬物を投与した後のマウス脾臓のRNAを抽出して、マイクロアレイ実験を行おうと考えています。 Trizolで抽出後、Dnase処理、フェノクロ→EtOH沈殿してRNAを精製しました。28S、18Sリボソームの比を電気泳動で確認して、Nanodropで260/280、260/230の比が2.0付近であることを確認しました。 Nanodropで測定するときに、核酸の濃度がある程度高い(500ng/uL以上)だと230nm付近が極小になるのですが、濃度を希釈して測定すると(200ng/uL程度)230nmより低い所の吸光度が上がらず波形が汚くなってしまいます。試しにこれらのサンプルをラベル化した場合、Cy3の取り込み効率が基準値以下になってしまい、マイクロアレイ実験のサンプルが調製できませんでした。 核酸の測定する濃度の違いによって波形が変化する理由がよくわかりません。もし知っている方がいらっしゃいましたらアドバイスの方よろしくお願いします。

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