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(無題) 削除/引用 No.3105-12 - 2010/09/02 (木) 22:56:40 - マイ >aimarさん、 ありがとうございます。試してみたいと思います。 >Tubeさん、 コメントありがとうございます。スペックシートを確認してみます。

(無題) 削除/引用 No.3105-11 - 2010/09/02 (木) 13:34:13 - Tube 透析でどれくらいの時間が必要かは、製品についてきてるスペックシートを見ればわかると思います。古典的な半透膜の場合、確か、1時間で９０％強が交換されるように記憶しています。ただ、これはあくまで外液が十分に攪拌されて、量も十分あった場合ですが、

(無題) 削除/引用 No.3105-10 - 2010/09/02 (木) 10:02:03 - aimar 小さいスケールでしたので、1リットルのビーカーを使っていました。 なので、volumeは1リットル程度だったように思います。 1時間おきだと少し短いように思います。 私は、1時間程度で同じ濃度の新しいバッファーに再度交換していました（つまり、同じ濃度のバッファーを二つ用意しておく）。つまりひとつの濃度につき合計2時間です。 ただそれだと時間がかかるので、はじめの透析(100mMに下げるときとか)はオーバーナイトでやって、次の日の朝から2時間おき（1時間+1時間）に変えていました。 何故、この方法でうまくいったのかはわかりませんが、その当時はモノを得ることが目的でしたので、それでよしとしました。 お役に立てれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.3105-9 - 2010/09/02 (木) 06:13:18 - マイ >[Re:4] aimarさんは書きました : > 透析においてイミダゾール濃度を段階的にさげてみたら解決したということがありました（例えば150mM→100mM→75mM→50mM→25mM....）。 > トビ主です。何度もすみません。 aimarさんに伺いたいのですが、透析の際、外液は何時間おきに交換されたでしょうか？（もし覚えておられたら液量も） 私はイミダゾール150mMで溶出しており、100mM、75mM、50mM、25mM、12.5mM、0mMと６段階の希釈をまずは試してみようと考えています。 細かいことかもしれませんが、１時間おきか２時間おきかでかかる時間がだいぶ違いますし、できれば参考にしたいので、差し支えなければ教えていただけませんでしょうか？よろしくおねがいします。

(無題) 削除/引用 No.3105-8 - 2010/09/02 (木) 01:17:59 - マイ > アルギニン・betaineなどの凝集抑制剤の作用機序はよくわかっていないそうですが、割と高濃度で加えますのでタンパクの周りにウヨウヨ存在している状態だと思います。betaineは電気的に中性ですから作用はマイルドだとは思いますが、タンパク-DNAの結合にも影響はあるでしょう。 > 特にアルギニンは正荷電を有しDNAにも結合するのでマイさんの実験には不向きです。 > aimarさんが教えてくださったようにイミダゾールの段階的希釈で成功すれば一番ですね。 ありがとうございます。タンパク無しのコントロールに同濃度のアルギニンを加えておけば良いという様な単純なことではない、ということがわかりました。 イミダゾールの段階的希釈を試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.3105-7 - 2010/08/31 (火) 10:14:45 - ats > atsさんに質問なのですが、タンパクは核酸結合アッセイなどに用いる予定ですが、このようなアッセイ系にbetaineなどが混入していても問題ないでしょうか？ アルギニン・betaineなどの凝集抑制剤の作用機序はよくわかっていないそうですが、割と高濃度で加えますのでタンパクの周りにウヨウヨ存在している状態だと思います。betaineは電気的に中性ですから作用はマイルドだとは思いますが、タンパク-DNAの結合にも影響はあるでしょう。 特にアルギニンは正荷電を有しDNAにも結合するのでマイさんの実験には不向きです。 aimarさんが教えてくださったようにイミダゾールの段階的希釈で成功すれば一番ですね。

(無題) 削除/引用 No.3105-6 - 2010/08/31 (火) 04:40:27 - マイ トビ主です。 atsさんに質問なのですが、タンパクは核酸結合アッセイなどに用いる予定ですが、このようなアッセイ系にbetaineなどが混入していても問題ないでしょうか？ 自分で調べてみたところ、アルギニンなども同様の効果があると知りましたが、やはり保存バッファーに入れると、アッセイにどうしても混入してしまいますが、何かネガティブな効果などあるでしょうか？（もちろん、ベタインやアルギニン入りの保存バッファーをタンパク無しのコントロールとして用いるつもりです）

(無題) 削除/引用 No.3105-5 - 2010/08/31 (火) 04:24:37 - マイ みなさま、お返事ありがとうございます。 >葉さん、 実はゲルろ過も行いましたが、回収率がとても低かったのです。目的タンパクがカラムに非特異的に吸着してしまったのかもしれません。（念のためコントロールとして以前扱ったことのある別のタンパクも同時にゲルろ過しましたが、こちらは普通に溶出されたので、操作自体はうまくいっていると考えています） >atsさん、 betaineなど、試してみる価値はありそうですね。ありがとうございます。 >aimarさん、 透析の際の外液のイミダゾール濃度を段階的に下げるという方法もあるのですね。これも試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3105-4 - 2010/08/30 (月) 10:31:40 - aimar 透析においてイミダゾール濃度を段階的にさげてみたら解決したということがありました（例えば150mM→100mM→75mM→50mM→25mM....）。

(無題) 削除/引用 No.3105-3 - 2010/08/28 (土) 15:54:01 - ats イミダゾールが凝集抑制剤として働いているとすると、中性の代替剤が必要かもしれません。 betaineやNDSB、またはtrehaloseが使えるかもしれません。 葉さんの仰るようにbuffer交換法は、ゲル濾過がbuffer液量も少なくてお手軽です。

できれば 削除/引用 No.3105-2 - 2010/08/28 (土) 13:33:13 - 葉 DNAとの結合とか見るんなら、除いた方がいいのでは。 もちろんmockにも同濃度のイミダゾールを入れることで対応は可能ですが。 わたしならゲル濾過のスピンカラムでバッファ交換をしてしまいますが。 5分でできるし。

タンパク精製後のイミダゾール除去は必須？ 削除/引用 No.3105-1 - 2010/08/28 (土) 03:26:04 - マイ TALONレジンでヒスタグタンパク質の精製をしています。 150mMイミダゾール入りのバッファーで溶出してある程度の純度のタンパク質を得ることはできたのですが、どうやら扱っているタンパクがやっかいなようで、透析中に大部分が沈殿してしまいます。なので、透析のステップを省けないか検討しています。 反応系にいれるのはせいぜい10分の1くらいなので、アッセイ系に15mMのイミダゾールが入ることになります。 タンパクは核酸に結合することが予想されており、ゲルシフトアッセイや、フットプリンティングアッセイなどに使おうかと思っています。 みなさまのご意見をお聞かせいただければ幸いです。よろしくお願いします。

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