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(無題) 削除/引用 No.3103-6 - 2010/08/30 (月) 16:48:30 - B4生 多分Ampは分解されやすいからだと思いますけど、サテライトが出来ていなければ、シングルコロニーをピックしてプレ培地用のAmp入り液体培地で培養すればいいと思いますよ 自分はいつもTFしたプレートからシングルコロニーを取って耐性抗生剤入りの液体培地で培養してストックにした後、ストックから少量取ってミニプレで確認して精製に入ります

ありがとうございます 削除/引用 No.3103-5 - 2010/08/28 (土) 15:41:55 - やまさき 皆様ありがとうございます。 シングルコロニーを拾うのが正統なやり方のようですね。そのように計画しようとおもいます。 あかね様。 ＞アンピシリン耐性のプラスミドの場合はトランスフォーメーションしてから、コロニーを再度ストリークしないと駄目なんですよ。 うーん。まったくもって不勉強で理屈が理解できません。アンプが殺菌性でなく静菌性だからでしょうか？耐性遺伝子でアンプが分解された頃合いにプラスミドのない菌が増え出すからでしょうか？厚かましいようで申し訳ないですが、理由についてご教授願えませんか？

(無題) 削除/引用 No.3103-4 - 2010/08/27 (金) 23:31:14 - あかね アンピシリン耐性のプラスミドの場合はトランスフォーメーションしてから、コロニーを再度ストリークしないと駄目なんですよ。

(無題) 削除/引用 No.3103-3 - 2010/08/27 (金) 22:25:22 - ami > 大腸菌のポリメラーゼによる変異の可能性を考慮すると、シングルコロニーをとるのは何となくリスクがあるような気がします。 取ったコロニーがちゃんとしたコロニーだと確認すればいいわけで。 変異が入ったものもまぜこぜで以下の実験を行うのが気持ち悪いです。

(無題) 削除/引用 No.3103-2 - 2010/08/27 (金) 22:22:04 - A 私はいつもプレーティング後にシングルコロニーを拾って発現チェック しています。確かにトランスフォーメーション後にそのまま培養にもって 言ったことが無いとは言いませんが異なる可能性を持ったクローン群から 始めることになるのはあまりいい気がしません。

BL21によるタンパク発現 削除/引用 No.3103-1 - 2010/08/27 (金) 20:36:52 - やまさき いつも勉強させてもらっています。 BL21DE3の大腸菌によってあるタンパク産生の実験を行う予定です。DH5aにてクローニングして、ミニプレまで終わっています。BL21にトランスするのですが、実験書によってはトランスのあと、プレーティングせずにそのまま一晩カルチャーして翌日誘導実験という場合と、プレーティングしてから翌日シングルコロニーをピックして一晩カルチャーして誘導実験する場合と、数個のコロニーを取って一晩カルチャーして誘導する場合がありました。大腸菌のポリメラーゼによる変異の可能性を考慮すると、シングルコロニーをとるのは何となくリスクがあるような気がします。（実際、ルシフェラーゼベクターで、メーカーから買ったプラスミドでは光るのに、自分でトランスしてからシングルコロニーを拾って増やしたプラスミドでは光らなくなったという経験があります。）皆様はどうされていますか？

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