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(無題) 削除/引用 No.3099-6 - 2010/08/31 (火) 12:25:59 - siRNA 自分の場合プライマーは 「Prime STAR Mutagenesis Basal Kit」を参考に作成しました。 そのプライマーデザイン法は点変異を入れるのに一般的な方法なので、キットを買わなくてもできます。 だいたい３０merくらいのプライマーになるはずです。 そのうちの6 merが変異されてても、プラスミドのようなきれいなTemplateを使用されるかぎりうまく増えるはずです。

６塩基のmutationについて 削除/引用 No.3099-5 - 2010/08/28 (土) 03:46:30 - あき ありがとうございます。 ６塩基の変異を入れれば、たしかに３塩基の変異よりもsiRNAが効かなくなるように思います。 成功さえたということは、primerはそれくらいの配列を変えてもPCRがかかったということですね。 ３および６塩基の変異を入れた、２種類のプライマーで行ってみたいと思います。

６塩基のmutation 削除/引用 No.3099-4 - 2010/08/28 (土) 03:40:01 - あき

(無題) 削除/引用 No.3099-3 - 2010/08/27 (金) 15:27:39 - siRNA 私はsiRNAですがそのような実験をやったことがあります。 siRNAのターゲットサイトは25塩基だったので、そのうちの真ん中付近の6塩基を変異させました。そしたら完全にうまくいきました。 なので３つの変異の位置を考えるよりも、もっと多くの変異を自分の都合のいい場所に入れるのがいいかと思われます。 あと、codon usageにも一応気をつけてください。

(無題) 削除/引用 No.3099-2 - 2010/08/27 (金) 12:36:58 - ＠ やってみないとわかりません。

３つmutationをいれるためのprimer作製のこつ 削除/引用 No.3099-1 - 2010/08/27 (金) 03:02:07 - あき 目的遺伝子のshRNA発現細胞株に、その目的遺伝子のプラスミドを導入し、いわゆるレスキュー実験を行おうと思います。 shRNAの効果がないようにプラスミドの方にshRNAの標的配列に3つのmutationを入れようと思います。 そこでprimerの設計についてのご質問なのですが、３つのmutationの位置に関しては何かこつがありますでしょうか？ もちろんアミノ酸の配列は変わらないようにしますが、例えば5'側に偏るようにしたほうがよいとか、まばらに入れた方がよいなど、何かこつがありましたらぜひご教示お願いいたします。 なるべく偏ったほうがprimerが短くなるので、かかりやすくはなるかと思いますが、いかかでしょうか。

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