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(無題) 削除/引用 No.3098-13 - 2010/08/28 (土) 20:19:56 - AP なんども話題にあがっていたのでいまさら聞くまでもないと思いますが、切り出しの時、DNAにUV被爆させないようにしていますか？ 同じ照射量でもDNAが長いほど影響がでやすい（コロニーが生えてきにくい）と言う面もあります。

(無題) 削除/引用 No.3098-12 - 2010/08/28 (土) 13:20:08 - 中年 セルフライゲーションばかり生えてきたということですが、それらが実際にセルフライゲーション産物であって、空ベクターと同じ構造を備えていることは確認されていますか？ 効率の低いライゲーションの場合は、ニックの入ったようなベクターが切れていい加減にライゲーションされてしまったような短いライゲーション産物が取れてくる（というより、求めるライゲーションの効率が低いのでその寄与が問題になる）ことがあります。ベクターのサイズも大きいようなので。

(無題) 削除/引用 No.3098-11 - 2010/08/28 (土) 00:19:25 - nnn >「カラムタイプのキットで精製」は何を使われていますか？ 私は、QIAGENのQIAquick PCR Purification Kitsのプロトコールを使っています。 （実際には、QIAquick Gel Extraction Kitと、同社のQIAprep Spin Miniprep KitのBuffer PBを組み合わせて使っています。） http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/dnacleanupsyschooser.aspx ただ、カラムタイプをお勧めしたのは、フェノクロ抽出を避けたい為ですので、 Q社以外でも大丈夫だと思います。 あと、うまくいかない要因として、もう少し考えてみたのですが、 ・SacIがちゃんと切れていない可能性 http://www.neb.com/nebecomm/products_intl/faqproductR0156.asp と、 ・SacIサイトとPciIサイトが近すぎて、PciIで切れていない可能性 が、ありますかね・・・。

(無題) 削除/引用 No.3098-10 - 2010/08/27 (金) 19:46:54 - key nnn様 「カラムタイプのキットで精製」は何を使われていますか？ 高価なので、いままで精製にはkitを使わずフェノクロエタ沈にしていました。 ただうちの研究室は貧乏なので購入できるかわからないのですが・・・

(無題) 削除/引用 No.3098-9 - 2010/08/27 (金) 19:27:55 - key 早速ありがとうございます。 nnn様 前回はBlunting High (TOYOBO)　で平滑化をしたのですが今回切らしてしまいT4DNA　polを使いました。「精製のステップのフェノクロエタ沈が、手技的にまずい」ということも考えられますので精製キットも使ってみようと思います。 Ｋｌｅｎｏｗで平滑化→Ｐｃｉ1はフェノクロエタ沈していました。記入漏れです申し訳ありません。 ザンギ様 ご指摘有難うございます。以後用語の使い方に気をつけます。 T様 ベクターの方は Ecl136I や EcoICRI を使うと SacI サイトがブラントに切れますよ。ありがとうございます。使っていない酵素ですが検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.3098-8 - 2010/08/27 (金) 19:02:53 - wwn 原因については他の方にお任せして、、、 とにかく目的のものさえ出来ればいいのであれば 方法をがらっと変えてみるってのはどうでしょうか。 例えば、私はIn-Fusionを用いたクローニングに感動を覚え 正攻法でうまくいかない時なんかは、ちょくちょく使っています。 学生さんと言うことなので、勉強のためには この方法でのクローニングに意味があるのかもしれませんが 気分を変えてみるのもいいんじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3098-7 - 2010/08/26 (木) 21:40:06 - AP >ＴＦはできているようですがセルフライゲーションばかり生えてきてしまいます。空ベクターをＴＦしても生えました。また、ＰＡＰしたベクターのみをｌｉｇａｔｉｏｎした場合ＰＡＰしなかった（Ｐｃｉ�Tまでの工程を行った）ベクターのみをｌｉｇａｔｉｏｎしたものの約半分生えてきました。 ベクターも切り出しをしたほうがよさそうです。アルカリ処理を経て精製されたプラスミドは部分的に解離して制限酵素で切れなくなります。しかし、そういうプラスミドも大腸菌に入れば（おそらくtopoisomeraseによって正常化されて）普通に機能します。 それと、T4 polの反応条件は？　普通の感覚で37℃で処理すると、exonuclease活性が優勢になって、削れ込みがおこって失敗しますので、12℃からせいぜい室温で処理すべきです（その点、制限酵素との同時処理はお勧めできません）。klenowによるfill-upは失敗が少ないですが、これも室温程度で十分で、温度を上げるのは削れ込みで効率を下げる可能性があります。 isoschizomerを利用するのはナイスアイデアですが、SacI末端のpolishing-upがフレームあわせを意図したものだとするとだめですね。

(無題) 削除/引用 No.3098-6 - 2010/08/26 (木) 21:13:51 - 。。。 手間のかかることされてますね。 私なら酵素消化時に(dNTPsとKlenow or T4DNApol、ベクターの方はphosphataseも入れる)を全て入れて数時間反応。 その後、ゲル切り出し・精製してライゲーションで終わり。 ＊T4DNA polでブラントやったことないですが、Klenowでは普通にできています。 まあインサートが5kbになっただけで入らなくなるヒトいますけどあなたは大丈夫ですか？

(無題) 削除/引用 No.3098-5 - 2010/08/26 (木) 20:53:37 - Ｔ ベクターの方は Ecl136I や EcoICRI を使うと SacI サイトがブラントに切れますよ。数ヶ月単位で時間を空費するのに比べれば安いものでは？ インサートの方は PciI-NdeI 切断（NEB buffer 2 では double digest、もしくはシークエンシャル）の後に dATP と dTTP のみ加えて Klenow 処理でＯＫ。

(無題) 削除/引用 No.3098-4 - 2010/08/26 (木) 20:38:58 - nnn 追記です。 >Ｋｌｅｎｏｗで平滑化→Ｐｃｉ1 このステップ間で精製は？単なる書き込みミスでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3098-3 - 2010/08/26 (木) 20:31:35 - ザンギ ＃使ってる略語があまり一般的ではないような？ ＃PAPとかTFとか断りなしには使いませんね。 ベクターのPciI消化で半分くらい切れ残ってるんでしょうか。 フェノールクロロホルム抽出をやたらとやっていますが、フェノールは水相へ 溶け込みます。これの持ち越しで酵素が働かないことがよくあります。 水飽和クロロホルムで抽出するといいです。 これだけのコンストラクションを大学院生に指示するラボなら、これくらいの ノウハウは持ってると思うのですが。 それから使ってる制限酵素は殆ど熱失活で済むものではないでしょうか？ http://www.neb.com/nebecomm/EnzymeFinderSearchByName.asp ここで確認してみてください。 熱で失活させてから、必要ならエタチンでバッファー交換すればいいです。

(無題) 削除/引用 No.3098-2 - 2010/08/26 (木) 20:30:38 - nnn 私でしたら、 ベクター 1)SacI 2)Blunting High (TOYOBO)　で平滑化 3)カラムタイプのキットで精製 4)PciI 5)ゲル切り出し・精製。 インサートも同様に、 1)NdeI 2)Blunting High (TOYOBO)　で平滑化 3)カラムタイプのキットで精製 4)PciI 5)ゲル切り出し・精製。 それぞれの精製物をライゲーション。 考えられる原因としては、 T4DNApolとKlenow Flagmentが、活性をコントロールするのが難しい酵素で かなりの確立で平滑化を失敗してしまう事があげられます。 あとは、実際に見ていないので言及するのは憚れますが、 精製のステップのフェノクロエタ沈が、手技的にまずいなど。

平滑化のクローニングでつまづいています 削除/引用 No.3098-1 - 2010/08/26 (木) 19:46:50 - key いつも参考にさせていただいています。 過去に似たスレはあったのでですがちょっと当てはまらないと思いしつもんさせていただきます。 私は大学院１年生でベクター【Ｓａｃ�T→フェノクロエタ沈→Ｔ４ＤＮＡＰｏｌ.でブラント→フェノクロエタ沈→Ｐｃｉ�T→ＰＡＰ→フェノクロエタ沈】に インサート【Ｎｄｅ�T→フェノクロエタ沈→Ｋｌｅｎｏｗで平滑化→Ｐｃｉ1→ゲル切り出し・精製】をあわせてligationしています。２ヶ月間上手くいきません。 ＴＦはできているようですがセルフライゲーションばかり生えてきてしまいます。空ベクターをＴＦしても生えました。また、ＰＡＰしたベクターのみをｌｉｇａｔｉｏｎした場合ＰＡＰしなかった（Ｐｃｉ�Tまでの工程を行った）ベクターのみをｌｉｇａｔｉｏｎしたものの約半分生えてきました。 目的のものはできていれば１３０００ｂｐくらいです。 インサートが約５０００bpと大きいことも影響しているのでしょうか？ 考えられる原因をご指摘いただければ幸いです。

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