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(無題) 削除/引用 No.3096-10 - 2010/08/27 (金) 12:33:05 - TS ＞こちらでも色々相談し、液体窒素で凍らせたまま1.5mlチューブとペッスルですりつぶしてみることになりました。 どんなペッスルがあるかわかりませんが、凍結組織は堅いですよ。 力強くごりごりできないときついんじゃないかと思います。 小さな乳鉢は、数百円くらいで売っていますので。

(無題) 削除/引用 No.3096-9 - 2010/08/27 (金) 11:06:25 - 筋肉番付 　皆様すばらしいアドバイスありがとうございます。 　骨格筋にしても大動脈にしても、凍結状態のまま砕いて粉状にしてしまうのがよさそうですね。こちらでも色々相談し、液体窒素で凍らせたまま1.5mlチューブとペッスルですりつぶしてみることになりました。 　2%のSDSと言えども不溶性のfractionがあるということで、深追いせずに遠心で除いてlysateを使うことにします。

(無題) 削除/引用 No.3096-8 - 2010/08/27 (金) 04:51:31 - without 組織からのタンパク抽出では可能な限りの早さで 組織中の全ての細胞がバッファーに溶解されるのが望ましいと思います。 なのでTSさんの仰るように液体窒素で十分冷やした乳鉢に さらに液体窒素を注いでその中でゴリゴリとパウダーになるまで破砕するのがいいです。 その後パウダーをこれまた溶かさないように液体窒素の存在下でスパーテルで掻き集めて チューブに移します。チューブも同様に液体窒素で冷やしておくといいでしょう。 その後ボルテックスしながらバッファーを加えて一気に溶解します。 SDSバッファーでやったことはないのですが、通常のトリス／NaCl／triton系のバッファーでは ホモジナイザー無しでもタンパク質は抽出できておりました。 気になるようでしたらその後ポリトロンでさらに砕いたら良いと思います。 また、大動脈のような小さい組織でしたら、テフロンを使えば バッファーは小さくて済むと思います。モーターで回すタイプのが良いです。

(無題) 削除/引用 No.3096-7 - 2010/08/27 (金) 02:12:59 - C 同じような事していますが、こうした組織の破砕では、はじめに、はさみで切り刻むところが一番重要みたいです。出来るだけ小さく切るようにしたほうがいいです。その間に分解とか生化学的にあまりありがたくないことが起きると困るので、この操作はSDSーlysis buffer中で行います。 SDSでも溶けないものはあります。骨格筋や心脈管系ではとくに。ただSDSの変性作用は時間依存的な面があるので時間をかけるとある程度は溶けます（2,3時間〜一晩室温でそのまま放置とか）。またたとえ他の方法で一度は溶けてもSDSに溶けないとSDS-PAGEやWBで分析するのは難しいので、とりあえずこのホールライゼートは厳密には筋肉のSDS可溶画分であると考えて進んだほうがよいとおもいます。 量の少ない組織はホモジナイズでロスする危険がありますね。ある程度細切したあと、組織が十分浸る程度の少量のSDS lysis bufferに数時間以上浸けておけばどうでしょう。あるいはこの状態で加熱とか。

(無題) 削除/引用 No.3096-6 - 2010/08/27 (金) 00:12:54 - TS 既出のものと似ている部分もありますが、特別な機械を必要としない方法として、 液体窒素で凍結→乳鉢ですりつぶす→Lysis buffer→ポリトロン はさみでミンス→Lysis buffer→ポリトロン あたりで大丈夫だと思いますが。 骨格筋などは、いきなりポリトロンは難しいと思います。 ある程度の大きさにしてからでないと。

(無題) 削除/引用 No.3096-5 - 2010/08/26 (木) 22:48:39 - 筋肉番付 ありがとうございます。 小さい金属ビーズなどを使う、いわゆる組織破砕機のことでしょうか？ あいにくこのような機械はないのですが、身近にあるもので似たようなことはできるのでしょうか？ よろしければ具体的な方法を教えて頂けないでしょうか・・・。 恐れ入ります。

凍結 削除/引用 No.3096-4 - 2010/08/26 (木) 18:29:09 - ats 専用の機器があると便利ですが、（チューブごと）液体窒素で凍結し、凍結状態のまま破砕＞Lysis Bufferを加える手法がありますよ。 破砕法もいろいろあります。

(無題) 削除/引用 No.3096-3 - 2010/08/26 (木) 14:48:43 - 筋肉番付 　アドバイスありがとうございます。 　実は既にソニケーター（当ラボには水浴タイプしかありません）は試したのですが、血管周囲が少し毛羽立つ程度の変化しかありませんでした。テフロンホモジェナイザーでは血管が輪ゴムというかスルメのようになってしまい、ポリトロンの方がまだマシでした。 　ポリトロンで溶け残った組織を集めてSDSバッファー中でソニケーションもしてみましたが、やはりそれ以上可溶化できませんでした。 　バッファーが多ければロスも少ないし、小さい組織の時は、やっぱり濃縮しかないんでしょうかね・・・。

(無題) 削除/引用 No.3096-2 - 2010/08/26 (木) 14:18:15 - うーん ポリトロンホモジェナイザーを使用すると最低でも500ulくらいは要りますからね。 ソニケーターで大動脈を破砕するのはいかがでしょう。ソニケータの先っぽを1.5 ml EPチューブに突っ込んで100 - 200 ulのlysis buffer内で壊すのはいかがでしょう。

繊維成分豊富な組織からのタンパク抽出 削除/引用 No.3096-1 - 2010/08/26 (木) 14:04:50 - 筋肉番付 よろしくお願いします。 マウス骨格筋と大動脈からタンパク抽出し、SDS-PAGEに使っています。ポリトロンホモジェナイザーを用い、2%SDSサンプルバッファー（20倍量）中で60秒程度砕いているのですが、以下の点でうまくいきません。 �@骨格筋・大動脈ともに繊維性成分がホモジェナイザーに絡みつくように多く残ってしまう。 �A大動脈は小さく、バッファーは500uL用いるとタンパク濃度が0.2mg/ml程度と薄くなってしまう。バッファーをこれ以上減らすのは困難。 �@についてはSDSサンプルバッファーといえども不溶性のものが残るのは止むを得ないのでしょうか？　それとも、もっと可溶化能の高いバッファーなどあるものなのでしょうか。 �Aについては濃縮するのも一法ですが、小さい組織からある程度の蛋白濃度（1mg/mL前後）を得たい時、よい方法はあるのでしょうか？ 恐れ入りますが教えて頂ければありがたいです。

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