全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

ありがとうございます 削除/引用 No.3095-7 - 2010/08/30 (月) 17:35:05 - shoman あかね様 ご返答ありがとうございます。 メーカーに問い合わせたところ、プローブの濃度は20ng/μlという回答が 来ました。しかし私の実験ではこれをハイブリバッファーでさらに５倍に希釈して使用しているため、シグナルが出ないのはプローブの濃度が薄すぎるためなのではないかと疑っております。 抗体の件に関しては大変有用なアドバイスありがとうございます。 Texas redではなく他の色素を用いて検出してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.3095-6 - 2010/08/29 (日) 04:14:38 - あかね プローブは市販のものではありません。プローブは共同研究で得た染色体DNAをPCRでラベルして調整しています。プローブの量は10 ng/µl 1x hybridization buffer (50% FA/2xSSC)です。Cot1 DNAをプローブのx50倍量入れています。以前、友人からもらった市販のプローブ(FITCラベル、会社は忘れました）をつかって同様にFISHをやったときは上手くいきました。 もしTexasRed以外の色素(FITC, Alexa488, Cy3, TMR, Cy5等）のついたAvidinをもっていたら、それでトライすることをお勧めします。TexasRedは第一選択の色素ではありません。 それと、当方ではBiotinシステムはembryoに使っていません。胚の細胞膜に内在性のビオチンによるノンスペがでるからです(ひょっとして、Strainによっては出ないのかも）。カルノア固定後に、充分HCl, Pepsin等でタンパク質を除去した染色体標本なら、Bitotinは使えます。PFA固定などのサンプルには使っていません。当方では蛍光色素で直接ラベルしたプローブを使用しています。先のコメントで抗体による増幅は必要ないと言ったのは、その為です。

ありがとうございます 削除/引用 No.3095-5 - 2010/08/28 (土) 12:32:21 - shouman あかね様 書き込み下さいましてありがとうございます。 Digと同時に使えるとのこと。安心しました。同時に使えるのならば、検出に用いるハプテンが異なる場合(Dig or avidin)でも同じプロトコールで出来るということですね。 ご指摘のTexas redの検出におけるFilter setについてですが、 私達もそこを疑い、確認を行いました。 方法は単純ですが、免疫染色を行い、Texas Red標識の２次抗体を用いてシグナルが得られるかどうかを確認しました。その結果、シグナルが検出出来たので、設定ミスによってFISHのシグナルが得られないのではないと判断しています。 mouseの胚でchromosome paintingを行っていて、抗体によるシグナルが不要とのことですが、もし差し支えなければどちらのメーカーの染色体プローブをお使いになっているか教えていただけますでしょうか？ 今現在プローブは上述の通りcambioのものを使用しておりますが、濃度などが不適切ではないかと考えています。 できればコンペティターも含めて使用時の濃度も教えていただきたく存じます。 末尾になりますが、御礼を申し上げるのは遅くなりまして、申し訳有りませんでした。引き続きご指導をお願い申し上げます。 以上宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.3095-4 - 2010/08/26 (木) 23:21:03 - あかね Chromosome paintingはよくやっています。しかもshoumanさんと同じような胚で。 PaintingのプロトコルはBAC等を使うプロトコルと全く同じです。抗体を使ってシグナルを増幅しているようですが、私の場合はその増幅ステップは必要なく、感度も高いです。 ビオチン標識したプローブでもworkしています。検出する色素を変えれば、もちろんDIGと同時に使えます。 すこし気になったのが、Texas Redについてです。適当なFilter Set (EX/EM)を使っていますか？ 実はちゃんと染まっているが、励起光/蛍光の組み合わせが適切でないことはないですか？ Good luck

ありがとうございます 削除/引用 No.3095-3 - 2010/08/26 (木) 22:50:59 - shouman AP様 書き込みありがとうございます。 すいませんでした。 Cambio(1187-4MB-02)の、Biotin標識プローブを使用しております。 コンパチブル（互換性）があるのかとのご質問に対して、 不勉強で恐縮ですが、Digとの互換性があるというお言葉の意味が判りません。 Digで検出している系をそのままavidinの検出系にあてはめることが出来るのか？ということでよろしいでしょうか？ 上述のように 私はBiotin 標識されたプローブを使用していて、 1st layerとして、Texas Red conjugated Avidin D 2nd layerとして、α-Avidin goat antibody Biotin-conjugated 3rd layerとして、1st layerと同じTexas Red conjugated Avidin D を用いています。 遺伝子プローブと同様のプロトコールで染色体プローブが目的の染色体にハイブリさせることができるならば、後はAbidinと抗アビジン抗体が正常にターゲットに結合してくれれば、検出はできるのではなかろうかと考えておりました。 ところが、（検出に用いるlayerは違えど）同じプロトコールで実験を進めたにも関わらず、染色体プローブでのみシグナルが得られなかったので、遺伝子と染色体プローブのハイブリさせ方に問題があるのではないかと考え、質問させて頂きました。 以上ご質問にお答え出来ているか判りませんが、ご返答させていただきました。 引き続きご指導を宜しくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.3095-2 - 2010/08/26 (木) 18:55:18 - AP >ちなみに染色体プローブはCambioから購入したものでして、調製はメーカー指定の方法で行っております。 製品を特定してもらえませんか？　勘違いでなければ、FITC、Cy3、あるいはBiotin標識の製品しかないようですが。DIGシステムとはコンパチブルなんでしょうか。

染色体プローブでのＦＩＳＨに関して 削除/引用 No.3095-1 - 2010/08/26 (木) 13:36:07 - shoman お世話になっております。 現在、マウスの卵および着床前の初期胚でＦＩＳＨを行っています。 プローブとして、４番染色体と、４番染色体上にある遺伝子領域を用いてます。 遺伝子のプローブに関しましてはＢＡＣクローンからインビトロジェン社のニックトランスレーションキットによってdig標識し作製し、シグナルを検出することが出来たのですが、染色体プローブの方は全くシグナルが検出できない状況が続いております。 ハイブリダイゼーションや抗体による検出の方法は遺伝子プローブと同様のプロトコールに従って行っていますので、プロトコールには問題はないであろうと考えています。 ちなみに染色体プローブはCambioから購入したものでして、調製はメーカー指定の方法で行っております。 遺伝子のプローブと染色体のプローブのハイブリダイゼーションから検出までの方法は同じものではいけないのでしょうか？ 解決策に関してどなたかアドバイスをお願いいたします。

全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---