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(無題) 削除/引用 No.3081-14 - 2010/08/26 (木) 16:13:23 - ？ 高尚なアドバイスする前に、他の人もおっしゃっていますが現状がよくわかりません。 やったことを示すのというのは、やったことをただ書くのではなくて 「ポイント」となることの情報がないとよくわからないのです。

(無題) 削除/引用 No.3081-13 - 2010/08/26 (木) 12:02:57 - Boston WB がうまくいっても shedding を証明できません。ICC の補足程度です。 私だったら、まず酵素活性がでない４°C 下で、薬剤刺激後であっても、受容体が細胞膜に留まっていることを証明します。そのあとはプロテアーゼ阻害剤などを使って、プロテアーゼが関与していることを証明します。 別のアプローチとしては、培地を PBS に置換して、薬物処理します。うまくいけば PBS 中に受容体が出てくるはずなので、質量分析で切断部位を同定します。共雑物はほとんど無いはずなので、WB により分子量の小さい受容体断片が検出できるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3081-12 - 2010/08/26 (木) 11:51:57 - み 確認ですが、染色とは培養細胞での染色ですか？組織染色ですか？ 最初の質問では「免疫組織染色」と記載されていたので組織と仮定すると、穴あけ操作なしでも細胞内蛋白も染まるのではないかと思いました。 そうするとsheddingではなく単なる分泌小胞などからの細胞外への分泌が起こっているという説明でも全てのデータの解釈ができるかも・・・・。 「plasma extraction kitでplasma proteinを抽出した」とのことですが、得られた画分は膜画分ですか？細胞質画分ですか？要するにcytoplasmとplasma membraneのどちらのplasmaを指しているのか分からない。私だけか・・・？ なんか説明不足・実験技量不足・結果の解釈の誤解などが複雑に入り組んでいるような

(無題) 削除/引用 No.3081-11 - 2010/08/26 (木) 11:50:52 - 異伝子 要はWBがうまく検出できていないということですよね？ 培養上清はWBにかけていないのですか？ ひょっとしたら濃縮する必要があるかもしれませんが、何故流さないのですか？ あと、目的の膜タンパク質がメンブレンに乗っていないかもしれません。pIなんかは泳動可能なpIですか？転写の方法とかは？ 膜タンパク質の場合、セミドライではうまくできないときもあるので私は二度やるのが面倒なのでwetでやってます。あとureaも入れてます。

(無題) 削除/引用 No.3081-10 - 2010/08/26 (木) 10:25:24 - う 前も質問しましたが、 WBで6well、10cm dishとかで調整したって言われても、 結局、１レーンあたり、どのくらいのタンパク質量がアプライされているのかわからないのですが。 あと。培養上清から免疫沈降してみると検出されるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3081-9 - 2010/08/26 (木) 10:05:03 - hanabi アドバイスありがとうございます。私の勉強不足により説明が曖昧で、伝わりにくく申し訳ありません。あるsolble typeのreceptorがalternative splisingによってのみできるのですが、薬剤投与によりsheddingでも一部productされるのではという話です。 1. HAECsの実験ではELISAのdataはcell lysa 600pg/ml, medium 0pg/mlが薬 　剤A投与後5分後にはcell lysate 100pg/ml, medium 800pg/ml程度という dataです。 2. ヒトのplasmaのELISAでも投与5分で100→5000程度になります。 3. stainingの実験では生細胞に対してcontrolと薬物負荷をおこなったもの 　 をABC法にて染色して、control群は内皮細胞が赤く染色されるが、薬剤投 　 与群は染色されませんでした。 4. WBに関しては、最初は6well dishを使用していたのですが、WBにてbandがでず、10cmdishでもbandが検出されず、15cm disでやっと薄いbandが検出できました。そこで、蛋白量が少ないことを疑い15cm dishを2枚にplasma extraction kitでplasma proteinを抽出して、sample buffer(cell lysis buffer, PMSF, complete mini, SDS, DTT)を加えて、蛋白量を測定し、蛋白量をそろえて、膜蛋白のcontrol, 薬剤負荷、cytosolのcontrol, 薬剤負荷を一緒に流しています。抗体に関しては染色で使った細胞外domainをepitopeとするもの、あとC端をepitopeとするものを使用しましたが、controlと薬物負荷での違い(bandの消失や分子量の違い)を検出できませんでした。 あと発現ベクターは当施設では予算や施設の問題で難しいかもしれません。 自分としては、ELISAのdataには自信があるのですが、WBでうまくいかないので、WBの実験自体、あるいはこの仮説自体に何か大きなミスを犯しているような気がしています。研究を始めたばかりで勉強中の身であり、研究員が少なく相談しにくいことから、このサイトを利用させていただいております。 長くなって申し訳ありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.3081-8 - 2010/08/25 (水) 08:49:24 - Boston 生細胞を蛍光抗体で染めることで、薬物A処理後のレゼプターの挙動が分かります。コントロールとしては、on ice で薬物A処理がよいかと思います。 目的を考えれば、WB にこだわる必要はないと思います。

(無題) 削除/引用 No.3081-7 - 2010/08/25 (水) 02:44:46 - b 全ての実験系が上手くいっていると仮定します。 結果をまとめると、 薬剤A処理群 ELISA (+)、免疫染色(-)、WB (+) 薬剤A非処理群 ELISA (-)、免疫染色(+)、WB (+) ということでしょうか。 細胞外領域がsheddingされた場合、細胞外領域に対する抗体を用いて細胞のLysateのWestern blottingを行っても、分子量変化は観察できません。分子量変化を見る場合は細胞内領域に対する抗体を用いたほうが適切です。 免疫染色の結果とELISAの結果からsheddingの可能性が示唆されるということですが、Western blottingでは薬剤処理の有無により存在量の変化がないということから、このレセプターは薬剤Aにより細胞内に取り込まれている可能性も考えられます。 この場合、膜に結合した状態で存在するので、細胞質と分離しても膜画分に検出されます。 おそらく、同僚の方が指摘したのはこのかもしれません。 一度、細胞膜の透過処理を行って染色するとよいと思います。 培養上清のWestern blottingについては、免疫沈降や限外濾過で濃縮してから検出した方がよいと思います。免疫染色でちゃんと染まっていてWestern blottingで感度が弱いのであれば、変性したタンパク質の検出には向かない抗体かもしれません。他に抗体があればよいのですが、抗体が一つしかない場合は、濃縮により検出が可能だと思います。

(無題) 削除/引用 No.3081-5 - 2010/08/24 (火) 12:14:39 - み その蛋白の発現ベクターでも作って強制発現系でもsheddingが起こるかどうか検討されてはどうですか？ それぞれの実験系（western,ELISA,staining)での抗体の反応性・特異性を確かめるポジコンにもなるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3081-4 - 2010/08/24 (火) 11:03:48 - う ＞免疫組織学染色において、薬剤A投与なしと投与ありでは明らかに染色性の違いがあります。 どう違うのでしょうか？ ＞しかし、薬剤のありとなしで、western blotting上のbandの違いがだせません。 >（15cm dish　2枚しようしてやっとWesternのbandが検出できるくらい） 確認ですが、15cm dish２枚でサンプルを調整したとは、どうやってですか？ 詳しく聞いてからでないと何とも言えないが、 サンプルのタンパク量が半端なく多すぎで、全くもって実験の信憑性が無い つまり、そのウエスタンは何を見ているのかわからない と思います。 まず、それぞれの実験(ELISA、免染、ウエスタン)では、検出感度が異なります。 また、同じ抗体が他の実験に同じように有用かどうかはわかりません。 その検討は？ また、よくわからないのは、 ウエスタンではやっと検出できている状態 その割に、plasma protein extraction kitで行なった実験の結果は「確実に」の発言 ELISAで変化あり、免染でも変化あり、 その割に培養上清のウエスタンは見えない、ウエスタンでもよくわからない。 ご自分では、統一してどう考えていらっしゃるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3081-3 - 2010/08/24 (火) 09:39:23 - hanabi お返事ありがとうございます。 抗体はshedingされたほうの、細胞表面にある受容体の細胞外domainを認識しているものと考えています。 WBに関しては、ご指摘のとおりsheddingして分子量が小さくなることから、 bandの位置が変わったり、bandが消失したりを期待したのですが、それは 現在のところ検出できていません。medium中のタンパク質も1度だけWBしましたが、そのときはbandが検出できませんでした。その原因の一つに受容体の量が少なすぎたというのはあると思います。 免疫染色の件は、targetが細胞外だったので膜透過処理はおこなっていません。

(無題) 削除/引用 No.3081-2 - 2010/08/23 (月) 20:33:40 - stu 話によると、少なくともその抗体はその受容体のsheddingしたほうの領域（細胞の外側）を認識していることですよね。 sheddingしているのであれば、WBして分子量が小さくなっていることは確認できないのでしょうか？Mediumu中のタンパク質をWBしたのでしょうか？ sheddingしていると考えるのであれば、それは必須のデータだと思います。 また、免疫染色する際に細胞の透過処理（Tritonなど）はどうしているのでしょうか？ PFA固定後、透過処理なしで行えば、基本的に細胞質は染まらないので、細胞膜タンパク質を染めることになると思います。透過処理しないと染まらないのであれば、細胞質が染まっているのかと思います。（個人的にその実験をやったことないので、記憶があいまいですが）

Western blottingと染色の結果の違いについて 削除/引用 No.3081-1 - 2010/08/23 (月) 18:37:14 - hanabi ELISAで大動脈内皮細胞の細胞膜表面にあるレセプターが、薬剤Aによりmedium中に遊離してきたことから、薬剤Aによるsheddingを疑っています。 免疫組織学染色において、薬剤A投与なしと投与ありでは明らかに染色性の違いがあります。（レセプターの細胞外ドメインをエピトープとする抗体） ある同僚からの指摘で、cytoslがそまっている可能性はないかとの質問をいただき、plasma protein extraction kitを使用し、western blottingをおこなったところ、確実に細胞膜蛋白のみにbandが存在し、cytosolにはbandは検出しませんでした。 しかし、薬剤のありとなしで、western blotting上のbandの違いがだせません。（抗体は染色で使用したものと同じものを使用） 有意差はありませんが、薬剤ありのほうが、bandが若干濃いくらいです。 ELISAと染色のdataとwestern blottingのdataの違いに苦慮しています。 細胞の膜表面にある受容体の量が少ないのが原因なのかとも考えています。 （15cm dish　2枚しようしてやっとWesternのbandが検出できるくらい） この件に関しまして、どなたかご意見をお聞かせいただけると助かります。

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