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(無題) 削除/引用 No.3072-4 - 2010/08/26 (木) 16:04:28 - koji Aさん、testさん 御回答ありがとうございます。 RIは使えませんので、DIGプローブで 頑張りたいと思います。 TSA法を試す前に、ハイブリ温度を上げる、 プローブの領域、など検討したり 隣の研究室で用いていたenvision polymerをつかった ISHも試しに借りてやってみようかと思います。 他にも 何かアドバイスございましたら ご教授ください。 よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.3072-3 - 2010/08/26 (木) 15:01:51 - test Aさんのおっしゃるとおり、RI標識プローブを用いるのが一番確実かと思います。 ただRIが使えない状況でしたら以下の論文で用いられているように、ハイブリとその後の温度をキツめに設定するのもS/N比を良くするのにいいかもしれません。 Nature Neuroscience　Volume:13,Pages:767–775　(2010)

(無題) 削除/引用 No.3072-2 - 2010/08/25 (水) 18:59:15 - A そちらの研究施設の状況にも寄りますがRI RNA probeを使えば少なくとも 検出感度は上がるはずです。ただDIG RNA probeと違って少しハードルが 高いので一度経験者に直接習わないとなかなか難しいとは思いますが。

GPCRのin situ hybridization について 削除/引用 No.3072-1 - 2010/08/22 (日) 05:40:20 - koji 現在GPCRをin situ hybridization　で染めようとしているのですが、 いまのところ「染まっている傾向がなんとなく見られる（教授に見ていただいたところ）」というだけで、 はっきりしたシグナルが得られていません。 染まっていそうな部分の発色を待つとバックの染色が濃くなって わかりにくくなってしまいます。 サンプル組織はスライドグラスにはりつけた生切片（10μm）を 使っています。 一般的な、検出したいものに特異的なDIG RNA probeを用いた、 NBT/BCIPのアルカリフォスファターゼによる発色を行っています。 プローブは約600bpのものを用いています。 振れる条件（プローブ濃度やハイブリ温度）は、結構検討しました。 いつも入れているポジコン（条件確定済み：同じ組織で他のmRNAを検出）は染まっています。 フルオレセイン蛍光発色や、可能であればチラミドシグナル増幅法も 検討しようかなと考えています。 in situ は初心者なので、幼稚で分かり難い部分もあるかと思いますが、 GPCRなど発現量の低いものをISHで染めるためのいいアイデアがある方は どうかご教授よろしくお願い致します。

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