実験初心者です。
はじめて質問します。
現在、ヒトの滑膜線維芽細胞を薬剤で刺激をして、いくつかの蛋白のリン酸化をWBで見ようとしています。0min~60minの間でポイントをおいて刺激のタイムコースを見ております。
milliporeの RIPA Lysis Buffer, 10x
sigmaのphosphatase inhibitor cocktail 1と2
を用いています。
lysis bufferを入れた後はon iceで30分放置したあとの上清を回収しています。
蛋白定量はBIO-RADのDc Protain Assay Reagent A,BとSを使っています。
そこから計算して、12μgの蛋白をSDSページで泳動させ、PVDF膜に転写します。
そして非リン酸化aktを認識する一次抗体を使い、いざ検出してみると、バンドの濃さが見事にバラバラです。
非リン酸化aktは同じ量なのにリン酸化したものはこう動くんだよ、というふうに比べたいのですが、それができないために困っています。
ちなみに確認のためストリッピングをしたあとβアクチンを検出してみるとしっかり濃さの揃ったキレイなバンドが出ました。
刺激時間は1時間未満なので純粋に非リン酸化のaktが増えたという可能性はないと思います。
今後他の蛋白のリン酸化(MAPKなど)も見ていこうとしているため、なにか原因、対策が分かれば、と思って質問させていただきました。 |
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