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(無題) 削除/引用 No.3067-9 - 2010/08/23 (月) 14:47:20 - あ み様 TK-1様 コメントをいただき、 ありがとうございます。 いただいたアドバイスをもとに 一度いろいろと試してみたいと思います。

http:// 削除/引用 No.3067-8 - 2010/08/23 (月) 01:09:49 - TK-1 Agilentのプロトコールでは固定後は1350xgということになっています。 一般的に（特に固定したあと）蛋白を含まない溶媒（PBSなど)中で遠心するときれいなペレットになりにくかったり、ペレットが緩くなったり、側面に付きやすくなります。そういう時には、1%FCS入りやBSAが少し入ったPBSで落としてやるとかなりましです。多くのプロトコールでglycineでquenchしたあとはPBS-washになっていますが、そこで少々のBSAを持ち込んでもChIPをする上で問題になることは無いので私の場合はBSA-PBSで洗いをしています。

(無題) 削除/引用 No.3067-7 - 2010/08/22 (日) 22:29:30 - み >[Re:6] あさんは書きました : > > み様 > > 昔、扱っていた別の細胞では1.5mlマイクロチューブ、アングルローター、 > 2500rpmで問題がありませんでしたので、いけるものだと思っておりました。 > > 話は変わるかもしれませんが、 > HL-60細胞の1.5mLマイクロチューブでの > 細胞回収は難しいのでしょうか（生きた状態での）？ HL-60だから無理ということはありえないでしょう。 単に細胞を沈降させているだけなので、g数を細胞の大きさ・重さに応じて少し変える必要があるだけでしょう。同じ細胞数でも細胞によってペレットの大きさが異なりますよね。その辺からも一くくりにして同じ操作で処理するのはどうかと思います。あくまで個人的意見ですが。 HL60って小さい部類ですよね。

(無題) 削除/引用 No.3067-6 - 2010/08/22 (日) 18:35:31 - あ み様 アドバイスをいただき、ありがとうございます。 グリシン中和まで、15ml遠心管で、 遠心後のPBS washを1.5mLチューブに スケールダウンしていました。 文献では1.5mLチューブで700×gと書いてありました。 >私も経験的にですが1.5mlのマイクロチューブ・アングルローターによる細胞スピンダウンは回転数上げないと（たぶん5000rpm以上＝2000gくらい）落ちにくい印象あります。 昔、扱っていた別の細胞では1.5mlマイクロチューブ、アングルローター、 2500rpmで問題がありませんでしたので、いけるものだと思っておりました。 話は変わるかもしれませんが、 HL-60細胞の1.5mLマイクロチューブでの 細胞回収は難しいのでしょうか（生きた状態での）？

(無題) 削除/引用 No.3067-5 - 2010/08/22 (日) 18:15:18 - あ qq様 アドバイスいただき、ありがとうございます。 抜いた上清を遠心すると沈殿ができるので、 細胞を吸っているのだと思います。 処理数の問題で1.5mlチューブを選択していましたが、 一度、15mlチューブ、スイングローターで挑戦したいと思います。 toyo様 アドバイスいただき、ありがとうございます。 ×gをrpm換算したものが、大体そのような条件になります。

(無題) 削除/引用 No.3067-4 - 2010/08/22 (日) 17:55:19 - み そもそも細胞数、固定の方法などどのような方法でされてますか？ 1.5mlマイクロチューブでってのがひっかかります。 例えば60mm-dishでも100mm-dishでもいずれでも良いのですが、そのくらいのスケールでも大概ホルムアルデヒドを培養中のdishに直接添加して、おそらく室温で10min放置後、グリシンで中和しますよね。その時点で5-15mlのスケールになっていると思うのです。 そうすると大概、15-50ml遠沈管でのwashになると思います。 この場合、大概、スイングローターでの遠心となり、沈殿はロスなく回収されます。 私も経験的にですが1.5mlのマイクロチューブ・アングルローターによる細胞スピンダウンは回転数上げないと（たぶん5000rpm以上＝2000gくらい）落ちにくい印象あります。ちなみに3000rpmってうちのだと800gよ。

(無題) 削除/引用 No.3067-3 - 2010/08/22 (日) 16:51:41 - toyo わたしもchipはやっていませんがコメントさせてください。 遠心力は回転半径×(回転数^2)に比例するものですので、 回転数(rpm)だけでは細胞にかかる遠心力の強さが分かりません。 参考URL: http://www.hitachi-koki.co.jp/himac/support/riron.html 1.5mLチューブ用の遠心機はアングルロータ(固定角)で回転半径が小さいものが多く、 遠沈管用の遠心機はスイングロータ(自由角)で回転半径が大きいものが多いです。 参考にされた文献等にそのあたりの記述はありませんか?

(無題) 削除/引用 No.3067-2 - 2010/08/21 (土) 22:20:32 - qq ChIPしたことないのに、書き込むのは申し訳ないのですが、本当にロスしているとして、 >1.5mLマイクロチューブでPBS洗浄、遠心（3000rpm, 5min）、上清を完全に抜く際、 のところを、スイングロータで遠心してください。1.5mlチューブ用のスイングロータがないのであれば、15mlチューブでもよいかもしれませんし、1.5mlチューブをどうしても使いたければ、50mlチューブに1.5mlチューブを入れて遠心するとある程度、効果が期待できます。 アングルロータで遠心すると、側面にも細胞が沈殿するので、遠心終了後に上清にふわふわと出てくる可能性があります。 本当にロスしているのか？ですが、上清を更に高速遠心して、得られた沈殿を2%SDSなどに溶解して、260nmでDNAを測定するとすっきり分かります。さほど問題がなければ気にしないで良いのではないでしょうか？

HL-60細胞のChIP assay 削除/引用 No.3067-1 - 2010/08/21 (土) 12:25:51 - あ いつも参考にさせていただいております。 同じことをやっている人がいないため、 ここで質問させていただきます。 HL-60細胞をホルマリン固定化後、 1.5mLマイクロチューブでPBS洗浄、 遠心（3000rpm, 5min）、上清を完全に抜く際、 どうしても細胞をlossしてしまいます（吸ってしまいます）。 もう少し遠心条件を厳しくしてもその後のassayに問題はないでしょうか？ （皆さんはどのような条件下で行われているでしょうか？） また、その後ペレットを液体窒素で凍結するのですが、 多少PBSが残っていても、ここである程度の水分は 完全にとんでしまうのでしょうか？ （保存するなら、ソニケート後の方が良いとは思いますが、 とある理由でここで止めなければならない状況です。） 初歩的なことではありますが、 ご教授いただけますと幸いに存じます。 どうぞよろしくお願い致します。

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