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ありがとうございました 削除/引用 No.3064-5 - 2010/08/22 (日) 22:13:59 - とつ ぶん様、ザンギ様、NEKO様 カスタムプライマーを注文することにします。過去ログも読みましたが、一般的なことからよくわからなかったので、回答頂き大変助かりました。 貴重なお時間を割いてコメントをくださり、有難うございました。 昔買って使われずに残っていたGateway系を使わせてもらっています。 主に使用していた方はもうおらず、指導教官もそこまで詳しくない且つラボに不在です。昔使っていた方に依頼され実験をしていたテクニシャンの方に、菌の扱い等の基本は教えて頂いていました。しかし、プライマーをどうしたかや配列解析については詳しくわからないと言われ、困っておりました。 今回は皆さまのお力をお借り出来ましたが、この先を続けるには勉強やその他が必要なことがありそうですね。兎も角、この度は御助言有難うございました。

(無題) 削除/引用 No.3064-4 - 2010/08/20 (金) 23:01:01 - NEKO シーケンサーの能力にもよるので何とも言えませんが、インサートが1kb位だったら、M13のforwardとreverseでいけるかもしれません。TaKaRaの受託解析だったら、全部読める確立が高いと思われます（TaKaRaの回し者ではないです・・・）。ただ、この場合、インサート中心部分のシグナルが弱くなるので、読み間違えがおきやすくなります。2kb位だと、さすがに無理だと思いますので、私だったら、インサート内部に２箇所くらいプライマーを設定して、一発で解析できるようにします。 ザンギさんの仰るとおり、カスタムプライマーを注文して、一発で済ませた方が、時間とコストの節約になると思います。

(無題) 削除/引用 No.3064-3 - 2010/08/20 (金) 22:39:54 - ザンギ 一般論で言えば、１パスで２kb読めるシーケンサは多分有りません。 内部配列が分かっていて確認のための配列解析でしょうか。 そうであっても両側のストランドを読むのが普通だと思います。それから、 マルチキャピラリのシーケンサだとRunの度にポリマーを消費するので、一度 で済ませるほうが安上がりです。 カスタムプライマーを合成するコストも、シーケンス反応一回分と比べて、 格段に高いわけでもないので、何度も再実験するよりは一発で済ませるほうが 経済的に思えます。 ｐＥＮＴＲに関しては過去ログに何か情報があったような、気がします。 それ以前にGatewayシステムを導入してるラボならそれなりに裕福なので しょう。ラボでそれなりのノウハウも蓄積してるでしょうから、ラボの人 と仲良くして、いろんなノウハウを吸収できるようにする努力も必要かと 思うのですが。

(無題) 削除/引用 No.3064-2 - 2010/08/20 (金) 22:24:05 - ぶん 使っているシークエンサーによります。 キャピラリーの長さや、使ってるポリマーによって全く違います。 300bpぐらいのものや600bp読めるもの色々です。 研究室の他の人に聞いた方が良いですよ。

シーケンスに使うプライマーの選択 削除/引用 No.3064-1 - 2010/08/20 (金) 22:07:39 - とつ ベクターに入れたインサート(1-2kbp程)の配列をシーケンスで確認したいと考えています。 M13のForwardおよびReverseプライマーの結合部位がベクターにあるようなのですが、両方の反応結果を合わせて全配列は確認できるものでしょうか？ T7やT3がよりインサート近くにあれば、そちらを使うのでしょうか？ それとも、インサート配列に結合するプライマーも合成し、2箇所以上から読んだ方がよいのでしょうか？ 使用しているのはpENTERベクターです。 よろしくお願い致します。

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