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(無題) 削除/引用 No.3045-3 - 2010/08/30 (月) 15:33:13 - きっちゃん ご説明ありがとうございます。リン酸の濃度を測ればいいのですね。 そこで、再度質問なんですが、標準のリン酸濃度を測定するために、現在リン酸二水素カリウムをしようして、反応をさせているのですが、青色にならないのですが、実験方法として、おかしいところがあれば教えていただきたいです。 方法としては、 Sampleと同様のバッファーを用いました。 0.1ml　スクロース/EDTA buffer 0.1ml　リン酸二水素カリウム（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mM） 　　　　（glucose-6-phosphateの代わりに） 0.1ml　imidazole buffer（100 mM　pH 6.5） 0.1ml　水　　　　　　　　　　　　　　　　　をチューブに入れる 　　↓ 2mlのtricholoroacetic acid（TCA）：ascorbic（10％：3%, w/v）を加える 　　↓ 3000rpmで10分間遠心を行う 　　↓ 1 mlの上清と0.5 mlモリブデン酸アンモニウム（1％, w/v）とクエン酸溶液（2％, w/v）を加える 　　↓ 700nmでモリブデンブルーの吸光度を測定する 長文・乱文になってしまいましたが、何かお気づきのことがあれば教えていただけると幸いです。

http://jn.nutrition.org/cgi/reprint/89/4/429.pdf 削除/引用 No.3045-2 - 2010/08/18 (水) 21:37:48 - ~ モリブデンブルー比色法で測れるのはリン酸濃度で、 Glucose-6-phosphataseの活性は遊離リン酸濃度から求められるのですよね。 おそらくは、無機リン酸のスタンダードを作って、 それで遊離リン酸濃度を求めているのではないでしょうか。 （ユニット数が既知の酵素が手に入れば、酵素のユニット数でスタンダードを作ったほうがより正確かもしれませんが、売っていなさそうですね） スタンダードも同じバッファー組成でつくり、 添加回収実験も行なって回収率で補正すれば、 それなりの精度にできると思います。

モリブデンブルー比色法での酵素活性測定について 削除/引用 No.3045-1 - 2010/08/18 (水) 19:24:38 - きっちゃん モリブデンブルー比色法を用いて、肝臓のGlucose-6-phosphataseの活性を測定しようと考えているのですが、最終的にどのように酵素活性を出したらよいのか分からず悩んでいます。 方法としては、 肝臓を冷えたスクロース溶液（250mM）に入れホモジナイズする 　　↓ 0.1ml　スクロース/EDTA buffer 0.1ml　100mM　glucose-6-phosphate 0.1ml　imidazole buffer（100 mM　pH 6.5） 0.1ml　liver homogenate　　　　　　　　　　　をチューブに入れる 　　↓ 37℃　15分　インキュベートを行う 　　↓ 反応を終結するために2mlのtricholoroacetic acid（TCA）：ascorbic（10％：3%, w/v）を加える 　　↓ 3000rpmで10分間遠心を行う 　　↓ 1 mlの上清と0.5 mlモリブデン酸アンモニウム（1％, w/v）とクエン酸溶液（2％, w/v）を加える 　　↓ 700nmでモリブデンブルーの吸光度を測定する というところまでは、文献で調べられたのですが、最終的に酵素活性をUnits/proteinで表そうと考えているのですが、測定して出てきた吸光度をどのように処理したらよいのかが分からず困っています。 どなたかご存知でしたら、アドバイス頂けると嬉しいです。 よろしくお願いいたします。長文・乱文失礼いたします。

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