全15件 ( 1 〜 15 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.3044-15 - 2010/08/20 (金) 12:43:14 - Boston 問題解決にはならないかも知れませんが、ストレプトアビジンーAlexa 488 で２つ目の抗体がどのように結合しているのか見るとヒントででるかも知れません。 ウェル表面、均一に抗体が結合しているのか、傷みたいに一部分に結合しているのか。

(無題) 削除/引用 No.3044-14 - 2010/08/20 (金) 12:12:14 - blank+high >複数のコメントからして、ブランクとして血漿を使われているのでしょうか？ 　まず、希釈はすべてBufferで実施しております。したがって、ブランクは血漿ではなく、Bufferですので血漿中の共存物質に非特異的に反応していることはありません。 　それから、希釈液は、Std.の調整も血漿の希釈も同じ希釈液を使用しております。検体に関しては20倍希釈して測定しており、かつ、添加回収試験においても実検体にリコンビ抗原をスパイクした条件でほぼ回収率100％ですので、測定系の対象物測定への正確性は確かです。 　今回の一番の問題は、Blankの上昇です。そこに対し、アドバイスいただけますと幸いです。よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.3044-13 - 2010/08/20 (金) 12:04:19 - Boston 血小板は Fc レセプターを発現しています。凝血させないで調製する血漿では、血小板がコンタミしやすいです。 複数のコメントからして、ブランクとして血漿を使われているのでしょうか？勝手に、バッファーだと思っていました。 もし、血漿をブランクとして使用されているようでしたら、血漿のクオリティーを疑って見る必要もあります。

(無題) 削除/引用 No.3044-12 - 2010/08/20 (金) 11:07:30 - DC 説明が不十分で申し訳ありませんでした。 私のこれまでのELISA経験は培養上清サイトカイン程度ですが、 自作のELISA系（Biotin-Avidin-HRP)では数百pg/mLまでは測定出来ていたので、 「ガン光りする」と表現しました。 ですが、他の方が仰っているように血漿中ではタンパク量が多いですし、 バックグラウンドを抑えるように抗体をTitrationしていると感度が鈍くなるのかもしれません。 あと、これは元ボスから聞いたテクニックですが、スタンダードもサンプルと同じ溶媒で希釈する（今回は正常血漿？）事で、サンプル-スタンダードの誤差を修正できる事があるそうです。 異伝子さんの仰る問題の一つの解決策候補として、にすぎませんが・・・

(無題) 削除/引用 No.3044-11 - 2010/08/20 (金) 09:59:09 - blank+high >>1. もう一度確認しますが、posiconではELISAは上手く行ってるのですか？ それらのELISA用（？）抗体はちゃんとあなたの系でworkしてるんですか？ はい。ELISAでの使用以外にも、免染、ウェスタン、IP等に使用しておりますが、特に不自由なく系はworkしていると考えております。 >>2.posiconで標準曲線は書けますか？ 　はい。現在、リコンビ抗原を用いてそれをStd.として標準曲線を作成しております。様々なvalidationの結果、系の正確性、再現性自体は申し分ない結果が得られているのですが、ただ、Blankがやや高く出てしまうのが気になっているところです。Abs.をすべて測定Abs.-Blank Abs.で統一すれば問題は特にありません。 >>3. posiconは大腸菌由来の組替え体ですか？ あなたの抗体はその組替え体を免疫して取得したものですか？ そうであれば、その「組替え体」に対する抗体が血清中の抗原に対して反応できるという保証はないわけですよね？ 現在、標準品は組換え抗原を使用しております。MoAbは組換え抗原から取得しました。もちろん、天然型に反応しないことを懸念して、天然物を精製し、組換え型との反応性の比較を行いましたが、確立したすべてのMoAbが天然型・組換え型に対し同等に反応することは確認しております。 　以上、説明不足であしからず。。。

(無題) 削除/引用 No.3044-10 - 2010/08/20 (金) 09:58:23 - 異伝子 > >>本題とはあまり関係ないかもしれませんが、血漿中に数ng/mLもあれば多少希釈してもガン光りすると思うのですが・・・ > > 　首記の件に関しまして、どのようなELISA系を用いてガン光するとおっしゃっているのでしょうか？通常の発色基質系を用いた系ででしょうか？詳しく説明していただけますと幸いです。 > ガン光り＝とてもよく反応している　と理解しましたが、どうなんでしょう。 blankに血漿を用いていたらその中にある抗原に反応するということでしょう。 また、サンプルと検量線で目的の抗原以外の成分が大きく違うと思わぬ結果が出たりします。普通はbufferを同じにするでしょう。でも血漿の場合たくさんのタンパクが入っているし、bufferとしての成分も随分違うのでどうしているのかと。そこんところを詳しく書くと解決するかも。

(無題) 削除/引用 No.3044-9 - 2010/08/20 (金) 09:47:49 - うーん >本題とはあまり関係ないかもしれませんが、血漿中に数ng/mLもあれば多少希釈してもガン光りすると思うのですが・・・ この意見に関しては、私は簡単にうなづけません。 抗体の善し悪し（affinityやavidity等）もありますし、決してこの限りではないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3044-8 - 2010/08/20 (金) 09:46:04 - うーん 1. もう一度確認しますが、posiconではELISAは上手く行ってるのですか？ それらのELISA用（？）抗体はちゃんとあなたの系でworkしてるんですか？ 2. posiconで標準曲線は書けますか？ 3. posiconは大腸菌由来の組替え体ですか？ あなたの抗体はその組替え体を免疫して取得したものですか？ そうであれば、その「組替え体」に対する抗体が血清中の抗原に対して反応できるという保証はないわけですよね？ もう少し、具体的に書いた方がいいですよ。

(無題) 削除/引用 No.3044-7 - 2010/08/20 (金) 09:22:15 - blank+high >>２つめの抗体を抜いて、ストレプトアビジン-HRP を加えた場合の発色はどうですか？アグっているストレプトアビジン-HRP がプレート表面に吸着されている可能性もあるかと思います。 すでに検証済みです。Bio-MoAbを抜いた系で反応させると、発色しないことが分かっているので、恐らくBio-MoAbがなんらかの影響を及ぼしていると考えております。 >>もしくは、手持ちの他クローンでたすき掛け（固相側×検出側）をし、最大のS/N比を出す組み合わせを見出したらいいと思います。 　MoAbの最適化の条件も検討済みです。おっしゃるようにいくつかのMoAbの組み合わせでたすき掛けをして、S/N比が最大の組み合わせが現組み合わせになっております。 >>本題とはあまり関係ないかもしれませんが、血漿中に数ng/mLもあれば多少希釈してもガン光りすると思うのですが・・・ 　首記の件に関しまして、どのようなELISA系を用いてガン光するとおっしゃっているのでしょうか？通常の発色基質系を用いた系ででしょうか？詳しく説明していただけますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.3044-6 - 2010/08/19 (木) 10:40:32 - DC 本題とはあまり関係ないかもしれませんが、血漿中に数ng/mLもあれば多少希釈してもガン光りすると思うのですが・・・

(無題) 削除/引用 No.3044-5 - 2010/08/18 (水) 18:17:55 - mAb バックグラウンド上昇の原因はいろいろあります。 ・mAbの相性 ・blocking剤 ・抗体固相化量 ・ビオチン標識抗体量 ・ストレプトアビジン-HRP量 etc… 一度、固相抗体なしで反応させれば、mAbの相性の点ははっきりすると思います。 もしくは、手持ちの他クローンでたすき掛け（固相側×検出側）をし、最大のS/N比を出す組み合わせを見出したらいいと思います。 固相に向いているmAbもあれば、検出に向いているmAbもありますよ。

(無題) 削除/引用 No.3044-4 - 2010/08/18 (水) 18:13:04 - Boston > 　考察としては、恐らくMoAb同士が非特異的に結合しているのではないかと考えているのですが。 ２つめの抗体を抜いて、ストレプトアビジン-HRP を加えた場合の発色はどうですか？アグっているストレプトアビジン-HRP がプレート表面に吸着されている可能性もあるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.3044-3 - 2010/08/18 (水) 18:10:58 - blank+high 説明が不十分で申し訳ありません。 　Blocking bufferには1%BSA/PBSを使用し、時間は90分（室温）です。 それから、ELISA plateの素材はポリスチレンのフラットボトムプレートを使用。 　洗浄液には、0.1% TWEEN20を添加しております。 血漿中には数ng/ml程度しか存在しておりませんので、１ステップの反応系では検出限界がかなり厳しい状態でした。 　ポジコンは血清の希釈品を使用しております。 以上、上記の条件の中で改善・改良ポイントあればご助言ください。

(無題) 削除/引用 No.3044-2 - 2010/08/18 (水) 17:45:39 - うーん もう少し詳細なprotocolをお書きになるとbetterかと。 blocking bufferの組成や、時間。 それからELISA plateの素材 それからそれからwashをそれほどまでしても抑えられないというとwashing bufferの組成を変えてみるのも手かと。detergent入ってます？ それから、amplifiedしないと見えないほどなのでしょうか？？ posiconはあります？ 血清の希釈とか。 詳細キボンヌですね。

ELISAでBlank上昇を抑えるには？ 削除/引用 No.3044-1 - 2010/08/18 (水) 17:07:35 - blank high はじめまして。 　現在、サンドイッチELISA系で血漿中のある蛋白を測定する系を構築中です。 　現状として、MoAbを取得し、エピトープの異なる2種のMoAbを用いてサンドイッチELISAを構築したのですが、BlankのODが上昇してしまいます。系はビオチン/ストレプトアビジン系でamplifyしており、HRP標識ストレプトアビジン反応後は洗浄も通常の倍(6回)行っております。 　考察としては、恐らくMoAb同士が非特異的に結合しているのではないかと考えているのですが（それ以外にも原因は考えられますが）、抗原との反応は抑制せず、この非特異的な反応を抑制するよりいい方法はありませんか？ 　ご助言よろしくお願いします。

全15件 ( 1 〜 15 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---