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(無題) 削除/引用 No.3043-11 - 2010/08/21 (土) 12:41:59 - issa みなさまのおっしゃるとおりです。コンタミの怖さを思い知りました。皆様の御意見をもとに、対処してみようと思います。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3043-10 - 2010/08/20 (金) 11:21:45 - stu issaさんが初めにしっかりしたバンドが出ると言っている事から、それは目的産物が増えていると皆さんも考えてコメントしております。 経験からコンタミ時の対処方なりをアドバイスしているのに、issaさんは自分が望む回答が得られるまで納得しないようですね。 何を知りたいのかしらんけど。 そもそも、その増幅産物が目的産物であるならば、PCRの原理的に考えて、なんらかの原因によるテンプレートのコンタミにによって産物が増幅したと考えることが当たり前です。（もしくはプライマーダイマーだった） それとも本当にDNAのない状態のプライマーのみのPCRでDNAが自然発生して増幅したとお考えなのでしょうか？ だれかがDNAテンプレートのない状態でもPCRができると言ってくれることを期待しているのでしょうか？

何を求めているのか分かりません 削除/引用 No.3043-9 - 2010/08/20 (金) 09:11:06 - ~ >シーケンスはしてないのですが、サイズは目的産物と合致しております。 >リアルタイムだと20サイクルというきわめて少ないサイクルでネガコンも立ち上がってしまいます！ >ポジコンとしてゲノムＤＮＡも一緒にかけていますが、同じサイクルであがってしまうのです。 まずはコンタミが疑われるでしょう。 ゲノムDNAでのコンタミは考えにくいと思いますが、 PCR産物のコンタミであればあり得るでしょう。 読む労力がたりないのであれば、その産物の中で切れる制限酵素で処理して、パターンがゲノムDNA由来の産物と同じかどうかを見ておいてはいかがでしょうか。 2種類の制限酵素で同じパターンであれば、プライマーダイマーの可能性は低いでしょう。 この追加情報の前に書いた人の半数くらいがコンタミを疑っていて、対処法も書いていますよね？ それに反応していないということは、予想される原因とその対処法を聞きたいわけではないということでしょうか？ 助けてと言われても、実際に貴方のラボで作業するわけにも行かないので、それ以上を求めるのは無理があると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.3043-8 - 2010/08/20 (金) 08:48:10 - issa シーケンスはしてないのですが、サイズは目的産物と合致しております。 リアルタイムだと20サイクルというきわめて少ないサイクルでネガコンも立ち上がってしまいます！ ポジコンとしてゲノムＤＮＡも一緒にかけていますが、同じサイクルであがってしまうのです。

(無題) 削除/引用 No.3043-7 - 2010/08/19 (木) 13:50:39 - ・・・ っていうか・・・ コンタミを疑わない、そういう思考回路が確立していないのに PCRをしていることがやばいぞぉっ。

(無題) 削除/引用 No.3043-6 - 2010/08/19 (木) 09:17:09 - ~ 私が経験したのは単にプラスミドのコンタミで、ピペットマンが原因らしく、 フィルター付きチップで解決しました。 まだ原因が分かっていないようですので、いったんその配列をシーケンシングして、何のコンタミなのかをはっきりさせると、問題解決に近づくかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3043-5 - 2010/08/19 (木) 00:53:52 - ザンギ 30サイクルでバンドになるほどPCRでDNAが増えてるのなら、相当量の鋳型の コンタミと思われます。 本当に目的のPCR産物でしょうか？ ポジコンの鋳型を増やすと、それに応じてサクル数が減りますか？ その時の変性曲線は確認されましたか？

(無題) 削除/引用 No.3043-4 - 2010/08/18 (水) 22:43:36 - stu 昔いた研究室でリアルタイムPCRで同じように水ネガコンでPCRがかかってしまうことがありました。（テンプレートはトータルcDNAでした） 考えられた原因は １、PCRの試薬を混ぜる部屋と、泳動後のゲルを捨てるゴミ箱＋オートクレーブする部屋が同じだったのですが、捨てたゲルやオートクレーブからDNAがエアロゾルとして空気中に舞って、コンタミする。 ２、オートクレープの中の水を介してオートクレーブした滅菌水、チップにコンタミする。 ３、試薬がコンタミしている。 ４、コンタミではなくプライマーダイマーだった。 ５、ピペットマンや机がコンタミしていて、PCR調整時に内蓋にいつの間にかコンタミしてしまう。 などなど、色々予想して、対処しました。ある程度はなくなったのですが、それでも、なぜかネガコンでPCRがかかってしまう学生はいました。。。 とりえあず、すべて（試薬、部屋、道具）を一新してみてはどうでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3043-3 - 2010/08/18 (水) 14:26:39 - Boston ChIP だと、PCR product のサイズは１００bp 程度でしょうか。プライマーダイマーの可能性はないでしょうか？ただ、しっかりしたバンドとのことなので、可能性は低いですが。

(無題) 削除/引用 No.3043-2 - 2010/08/18 (水) 13:47:30 - g-aj DNAのコンタミだと思います。 SYBR GREENの試薬、プライマー、水、PCRチューブを 一新した上で、フィルター付きチップを使って 再度実験してみてください。

SYBR　GREENのPCR！templateいれなくてもバンドがでる！ 削除/引用 No.3043-1 - 2010/08/18 (水) 13:39:34 - issa いつもお世話になっております。 DNA promoter領域のPCR（ChIP assay）を行っています。SYBR Greenを用いてrealtime PCRを行ったところ、templateにネガコンとして、水を用いたものでも増幅が起こってしまいます。 　同様の試薬を用いて、普通のｻｲｸﾗｰを用いて、同様の条件でPCRを行いこれを電気泳動してみました。すると、またもや、templateが水の場合でもしっかりバンドがでてしまいます。PCRサイクル数としては30サイクルです。 　templateが水なのに、バンドがしっかりでる。このような経験をされたかたおられましたら　助けてください・・・・

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