Bio Technical フォーラム

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Primerについて教えて下さい。（Quick change) トピック削除
No.3038-TOPIC - 2010/08/17 (火) 23:08:19 - PCR
Quick change法にて1塩基変異のプラスミドを作製する為に、
プライマーを作製しました。
設計をミスしてまいどちらも同じ方向に増幅するようなプライマーを設計してしましました。
同僚に、同方向に伸長するから増幅しないと言われました。

ふと思ったのですが、２本鎖、環状プラスミドから作製した同方向の伸長した１本鎖同士なら
結果的にアニーリングすると思うのですがどうなのでしょうか。

分かりにく文章で申し訳ございません。
　
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(無題) 削除/引用
No.3038-16 - 2010/08/18 (水) 15:52:28 - mom-a
No.3038-7をスルーしちゃいましたね？
何名かの方がおっしゃっているように、落ちついて「図」を書いてみることです。5角形の絵ですよ？ATCGとか、記号だけで並べているから混乱するのです。

センス鎖とアンチセンス鎖 削除/引用
No.3038-15 - 2010/08/18 (水) 15:35:18 - stu
プライマーの５’には確かにリン酸基は付いていませんが、それは今の話と全く関係ありません。

おそらく投稿者さんはPCRを知ってはいるけど、理解してせずに実験を行っている人なのでしょう。
PCRがどのようにDNAを合成する反応であるのか、自分で図を丁寧に書いてみてください。特に５’と３’を常に気にしながら。
それでも理解できないようなら、あなたはかなり勉学のセンスがない。

(無題) 削除/引用
No.3038-14 - 2010/08/18 (水) 13:28:48 - ats
「5'」や「3'」の意味を調べましょう。

(無題) 削除/引用
No.3038-13 - 2010/08/18 (水) 12:50:56 - PCR
5`末端にリン酸がついており、3`末端のOH基があり、それで伸長の方向性が決まるのはわかるのですが、合成プライマーは5`末端はリン酸化されていないのではないでしょうか？
合成オリゴを、平滑末端部位などに挿入する際にリン酸化する必要があったので、リン酸基はついていないと思っていたのですが・・・。

(無題) 削除/引用
No.3038-12 - 2010/08/18 (水) 08:05:18 - ぶん
DNAの二重螺旋についての部分を教科書で読むと良いと思います。
DNA（primerも）には向きがあるので
5'−−−3'
5'−−−3'
は　二本鎖にはなれません。

例えば
http://www.biology.arizona.edu/biochemistry/problem_sets/large_molecules/06t.html

ここの下の部分のDNAの図を見てください。

(無題) 削除/引用
No.3038-10 - 2010/08/18 (水) 01:16:38 - PCR
疑問なのが、
合成プライマーに5`末端や3`末端を規定するものが付加されているのでしょうか。
されているなら納得するのですが、プライマーを調べてもあまり出てこないもので。。。

(無題) 削除/引用
No.3038-8 - 2010/08/18 (水) 00:47:28 - 774
投稿がかぶってしまいました。
ああああさんと同じなので、スルーしてください。

(無題) 削除/引用
No.3038-7 - 2010/08/18 (水) 00:45:24 - 774
（１）がどのようにアニールするか図に書いてみてください。
ちょっとした勘違いでしょう。

(無題) 削除/引用
No.3038-6 - 2010/08/18 (水) 00:43:57 - ああああ
5'−−−3'
3'−−−5'

5'−−−3'
5'−−−3'

どちらでも二本鎖になると考えてるんでしょうか？
教科書を読んでください。

(無題) 削除/引用
No.3038-5 - 2010/08/17 (火) 23:47:42 - PCR
基本的なことを教えて下さい。
どうして@はアニールしないのですか？

ダウト 削除/引用
No.3038-4 - 2010/08/17 (火) 23:38:33 - ami
@はアニールしません。

(無題) 削除/引用
No.3038-3 - 2010/08/17 (火) 23:32:28 - PCR
例えば２本差の環状プラスミドで

5`.....ATgCg.....3`
3`.....TACgC.....5`

というものに対するプライマーを

@5` TACgC 3`
A5` ATgCg 3`

で作製すると伸長方向は同じになりますよね？でも環状なのでグルッと伸長させれば最終的には２本鎖が出来上がって、アニーリングするのではないかなと思うのです。
いかがでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.3038-2 - 2010/08/17 (火) 23:20:03 - y
２つとも同方向と言うのがイメージできないのですが、どちらかは普通に5'→3'でその相補鎖になるべきもので5'→3'でなくて3'→5'に配列を並べてしまったということでしょうか？
だったら、元のプラスミドにその配列が無い可能性が高いので、間違って作ってしまった方ではアニーリングしないのではないでしょうか？
もっとも、たまたまその配列がプラスミドにあるなら話は別だと思いますが。

Primerについて教えて下さい。（Quick change) 削除/引用
No.3038-1 - 2010/08/17 (火) 23:08:19 - PCR
Quick change法にて1塩基変異のプラスミドを作製する為に、
プライマーを作製しました。
設計をミスしてまいどちらも同じ方向に増幅するようなプライマーを設計してしましました。
同僚に、同方向に伸長するから増幅しないと言われました。

ふと思ったのですが、２本鎖、環状プラスミドから作製した同方向の伸長した１本鎖同士なら
結果的にアニーリングすると思うのですがどうなのでしょうか。

分かりにく文章で申し訳ございません。
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