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(無題) 削除/引用 No.3037-3 - 2010/08/18 (水) 10:20:56 - レトロウイルス atsさん ありがとうございます。 > 通常は、HSV-tk promoter（プロメガの可変型等）を筆頭にPGK promoter・UBC promoterなどが汎用されますが、自作でも構いません。これらのpromoter活性も細胞内の状況により変動する可能性はあります。そのため、異なる細胞間での比較は絶対的なものではないことを考慮してください。 自作でも大丈夫なようですが，あまりそのような文献を目にしたことはありません。 もし，何か文献などご存知でしたらご教授いただけないでしょうか？ > 変動する要因を増やさないためにも、異なる細胞種でも同じ内部標準ベクターを使うのが一般的です。 やはり，ころころと変えるのは良くないのですね。 > また生データとして（時系列で）内部標準値が大きく変動する場合は、promoterが適切でない可能性があります。自作すると他の論文データとの比較が「より」困難になる欠点があります。 なお、実験としては内部標準と測定用ベクターの比を検討するくらいではないでしょうか。 この点，ご指摘ありがとうございます。 これまでにもベクター比を1；10〜1；50ま振っていたのですが，プロメガなどでは1；100でも良い場合もあると言うことでしたのでもう少し検討したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3037-2 - 2010/08/18 (水) 09:33:14 - ats 内部標準用のプロモーターとして、CMVやSV40 "promoter" は、使わない方が良いです。 この理由として、これらは簡便に"promoter" と呼ばれていますが、強力なenhancerを含んでいるからです。そのため、別のplasmid上にある測定用promoterも活性化する可能性もあるし、enhancer自体の活性も細胞種によって大きく変動するからです。プロメガのプロトコールをお持ちならよく読みましょう。 通常は、HSV-tk promoter（プロメガの可変型等）を筆頭にPGK promoter・UBC promoterなどが汎用されますが、自作でも構いません。これらのpromoter活性も細胞内の状況により変動する可能性はあります。そのため、異なる細胞間での比較は絶対的なものではないことを考慮してください。 変動する要因を増やさないためにも、異なる細胞種でも同じ内部標準ベクターを使うのが一般的です。 また生データとして（時系列で）内部標準値が大きく変動する場合は、promoterが適切でない可能性があります。自作すると他の論文データとの比較が「より」困難になる欠点があります。 なお、実験としては内部標準と測定用ベクターの比を検討するくらいではないでしょうか。

レポーターアッセイの内部標準ベクターの選択 削除/引用 No.3037-1 - 2010/08/17 (火) 20:40:58 - レトロウイルス 現在，レポーターアッセイでウイルスプロモーター・エンハンサーの検索をしています。 実験系はクロンテックの分泌型SEAP/luciferaseアッセイキットを使い 対象のウイルスプロモーターをSEAPにつないで種々の細胞株での活性をみています。 その際，内部標準として分泌型ルシフェラーゼ（CMV制御）を使用しています。 経時的に上清を回収して測定すると，SEAP・ルシフェラーゼともにバックグラウンドよりも優位な発光が見られますが どの時点でもこれらの発光がほぼ同じ（SEAP/Luciferaseが1倍から10倍，時に10倍以下）になります。 成書やプロメガのサイトなどでは内部標準はあまり発光せず， かつバックグラウンドよりも優位に測定値になるように調整するようなことが書かれていました。 皆様がこのようなアッセイ系を組む場合， 内部標準の決定にはとりあえずトランスフェクションして， ベクター比やプロモーターを変えて試行錯誤するのが一般的なのでしょうか？ また，もし好ましい内部標準ベクターがなければ，自作しても良いものなのでしょうか？ 例えば，プロメガのコントロールベクターからプロモータだけを クロンテックの分泌型ベクターに乗せ換えたりしても良いのでしょうか？ 最後に，複数の細胞株でプロモーター活性を比較するときに 内部標準が異なっていても良いのでしょうか？ （原理的には補正できれば良いと思うのですが， このようにしている論文などをみかけたことがないのですが） 何かアドバイスなどあればよろしくお願いいたします。

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