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(無題) 削除/引用 No.3035-6 - 2010/08/17 (火) 22:00:03 - Actias 「レポーター プロモーター コレクション」 で検索すると、目的のものが市販されていたりして。

(無題) 削除/引用 No.3035-5 - 2010/08/17 (火) 16:37:43 - GE 直接的な回答ではないですが、形質転換に関する質問は、このフォーラムで頻繁に議論されていることだと思います。 ですので、過去の形質転換に関するトピックを読んでみるとヒントがあるかもしれませんよ。

(無題) 削除/引用 No.3035-4 - 2010/08/17 (火) 16:07:10 - ~ そもそもどのような操作をやっているのかほとんど書かれていませんので、 考えられることと言っても、貴方の操作について考えようが無いと思いますが。 やってもらった先生はベクターワークの経験がどの位の人で、 自分がやった結果を見て何と言っているのでしょうか？ １．DNAの末端があっていない ２．アルカリフォスファターゼ処理不足またはかけ過ぎ ３．DNAにUVをあてている ４．コンピタントセルが死んでいる ５．撒くプレート（に含まれる抗生物質）を間違えていて、生えないのが正解 などは考えられると思います。 何かこれらの可能性を潰せるコントロールは置いていますか？ A.（他の人が切った末端の合う）pBlueScriptなど他のベクターにライゲーションしてみる B.ライゲーションに用いるDNAには一切UVランプを照射しない C.ポジコンを一緒にトランスフォーメーションしてみる などで、問題の一部は潰していけるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3035-3 - 2010/08/17 (火) 16:04:56 - ＠＠＠＠ まずは、コントロール実験の実施状況を箇条書きにして報告しよう！

(無題) 削除/引用 No.3035-2 - 2010/08/17 (火) 16:01:40 - 774 もう少し詳しい情報が必要です。 1)Insertの由来は？　他のplasmidからの切り出し? PCR産物? 2)使用した制限酵素の種類 3)おおよそのプロトコルと各段階でのポジティブorネガティブコントロールの状況 等の情報があれば、アドバイスをもらいやすかと思います。

ラーゲーション、トランスフォーメーション 削除/引用 No.3035-1 - 2010/08/17 (火) 15:18:30 - いおり 医学部の修士1年の学生です。 pGL3-Basic (4818 bp) というベクターに、9kbpくらいのinsertを3回に分けて挿入して、ルシフェラーゼアッセイ用のレポーターベクターを作製している最中なのですが、何回やってもコロニーが出来なかったり、ベクターのセルフライゲーションのコロニーばかりが出来てしまいます。 insertのサイズが大きすぎるからだと考え、先生と相談して3 kbp 2kbp 4kbpの３段階にわけて挿入しようということになりました。ところが、最初の3kbpのinsertすらライゲーション→トランスフォーメーション後にコロニーが全く出来ないのです。私のテクニックの問題かと思い、先生にやってもらったのですがそれでも出来ません。大腸菌はJM109を使っていますがそれ以外の大腸菌(DH5α)でも同じく、コロニーが出来ません。 このレポーターベクターが出来ないと実験が全く進まないので相当困っています。(5月のあたまからやっています。)もう、精神的にかなりつらいです。 何か、考えられることがありましたらお願いします。

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