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(無題) 削除/引用 No.3033-7 - 2010/08/19 (木) 09:35:41 - 通りすがり No.3033-5を読んだ上でtoyoさんと同意見です。 以下、U937に関する知識がないため、的外れな意見かもしれませんが。 そもそもPBSでwash、剥がれた時点で何らかのシグナルが入っている・もしくは失っていると考えるほうが妥当だと思います。 それらの影響は >PBSでウォッシュしないとタンパクの実験をするうえでFBSなどが実験制度を狂わせる よりも少ないものなのでしょうか？ FBSなどが精度に与える影響としては、lysis後のタンパク濃度測定がブレる・抗体がクロスしてしまう　くらいしか思いつかないのですが、 前者はそもそも濃度測定せずにSDS入りのlysis bufferでlysisして、house keeping geneでnormalize、 後者は予備実験で確認しておく、 すれば回避できるように思います。 タイムコース通じての良いhouse keeping geneがあることが必須になりますが。

(無題) 削除/引用 No.3033-6 - 2010/08/19 (木) 05:19:29 - without タイムコースがどのくらいのスケールなのかわからないですが（刺激後２日、４日後？）、 細胞がくっついた４日目からタイムコース実験を始めるのはどうでしょうか。 的外れでしたらすみません

(無題) 削除/引用 No.3033-5 - 2010/08/18 (水) 19:30:03 - 接着細胞のタイムコースのやり方 いろいろありがとうございます。 上司いわく『マクロファージ用細胞のような接着性の細胞は、剥がして遠心かけても完全に沈まないから、吸引した時になくなってしまっている。』とのこと。 だから、はっきりその細胞のバンドが出てこないと言ってます。 また、PBSでウォッシュしないとタンパクの実験をするうえでFBSなどが実験制度を狂わせると言っておりました。 しかし、この方法ですと、結局接着細胞、もしくは浮遊細胞を分けて分析にかけることになるので、1日目、2日目というタイムコースからの意味合いは少しずれると思っております。 遠心かけたあとの上澄みから少し採取して本当に沈んでないか確認しようと思います。 あと、無駄なような気がしますが、プレートの数を増やして両方採取できるようにしてみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.3033-4 - 2010/08/17 (火) 22:57:34 - toyo そもそもPBSでwashしないという選択肢はないのですか? 血清中のアルブミンや刺激物などとウェスタンのバンドが重ならなければ、 問題ないような気もしますが。

(無題) 削除/引用 No.3033-3 - 2010/08/17 (火) 22:09:23 - Actias どっちも、はがして遠心で回収ではだめ？

(無題) 削除/引用 No.3033-2 - 2010/08/17 (火) 22:03:32 - うーん どちらもやるんじゃないかな？ まあでも、接着細胞と浮遊細胞とを別々に回収するとかなりデータにバイアスがかかっちゃいそうなので、combineもしちゃうかな。一応そのことを論文中で書いた方がbetterだと思いますが。

接着細胞　はがし方、タイムコース 削除/引用 No.3033-1 - 2010/08/17 (火) 12:18:06 - 接着細胞のタイムコースのやり方 初歩的な質問ですみません。 U937をTPAで刺激して、タイムコースを行いウエスタンブロッティングしようと思います。 ４日間ほど培養すると完全にプレートにくっついてくれるので、直接プレート上でライシスバッファーを入れて剥がしながら溶かすことができるのですが、培養して２日目などは、細胞が接着しているのですが、PBSで洗浄するとはがれます。はがれた細胞に関してはライシスバッファーで溶かしてタンパクを抽出しているのですが、dishのほうにも接着細胞に分化している細胞が半分くらいあり、前者同様に回収しております。 結局二日目の細胞培養では、すぐにはがれていしまう細胞と張り付いている細胞が半分半分くらいで、これらの回収の仕方が別々になってしまっているので、どのようにしてよいかわかりません。 一緒にしてしまってもよいのでしょうか？むしろしたほうがいいのでしょうか？ このようなタイムコースをやられている方で、どのような工夫をされているか教えていただければと思います。

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