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(無題) 削除/引用 No.3030-11 - 2010/08/25 (水) 22:30:45 - 悪地蔵 GoTaqで試された際のMgCl2濃度はどうされましたか？ GoTaqの通常のbufferですと1.5mMですが、 ABIのマスターミックスはこれが2.5mM程度入っていると思われます。 バッファーが最適化されていることも考えられますが、 MgCl2濃度の違いが原因の一つではないかと考えられます。 ともあれ、問題が解決されているとのことですので 蛇足であります。

PCRまで 削除/引用 No.3030-10 - 2010/08/21 (土) 18:04:16 - さつこ ありがとうございました。 1st PCR --> ABI universal mastermix 　（8割アプライし、薄いバンドが確認されました） 2nd PCR --> promega GoTaq, template 1/8-1/4 dilution でプロダクトの1/10をローディングしたところ、ゲルでしっかり可視化できました。上手く増幅されたと考えています。 クリーンアップしてシークエンスをみたいと思います。 1st PCRでGoTaqを使っても全くバンドが見えなかったのがなぜか、 単純にアンプリコンの量の問題だけなのか・・・・ 疑問が残りますが。。。。 とりあえず、うまくいきました。 どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3030-9 - 2010/08/18 (水) 11:47:02 - nnn 私でしたら、まず試しに1stPCRのサイクル数を増やしてみますがね（+5サイクルほど。ABIのqPCR試薬で）。 まだPCR反応が飽和状態に達して無いと考えて。 また、2ndPCRを行う時のコンタミのリスクを避けるためにも。 もちろん40サイクルでは検出感度以下だった非特異的な産物も見えてくる可能性はありますが。 >1stPCRをGoTaqを使っても駄目なのに、1stPCR->ABI、2ndPCR->で増幅されるのはどのような可能性が考えられるでしょうか。 えーっと・・・。このトピをよく解釈していただければ。 あと、試薬の説明書はよく読まれたほうがよいですよ。 それぞれの試薬に何が含まれているのか。 今回の場合はウラシルDNAグリコシラーゼについてでしょうか。 （答えを書き込むのは簡単ですが。何事もお勉強です。）

抜けてました 削除/引用 No.3030-8 - 2010/08/18 (水) 09:04:50 - さつこ ネガコンとして考えていた組織（B)でも、同じ長さ（予想されるアンプリコンの長さ）の所にバンドが見えました。 すみません、抜けてました。

ポジコンでてます 削除/引用 No.3030-7 - 2010/08/18 (水) 09:02:48 - さつこ どうもありがとうございます。 最初の書き込みの詳細が足りませんでした。 ポジコンとして考えている組織（A)からのRT産物ではPCR（リアルタイムの系）で、バンドが見えます。 しかし、ネガコンとして考えていた組織（B)（文献上、その組織で発現があるかどうかは、あるとも、ないとも。。。。。報告がありません。）しかしAの特異的マーカー遺伝子と言われているので、ほんとに特異的か、それとも別のｃDNAを増幅しているのか、はっきりさせるために、シークエンスを読んでみようと言うことになったわけです。もちろんゲノムのコンタミの可能性は否定されています。 1stPCR（リアルタイム）のサイクル数は40サイクルで回しています。 nnnさんが仰るように、1stPCRはABIのqPCR用の試薬、2ndPCRをGoTaqを使ってみる、という事ですが。。。。。 1stPCRをGoTaqを使っても駄目なのに、1stPCR->ABI、2ndPCR->で増幅されるのはどのような可能性が考えられるでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3030-6 - 2010/08/18 (水) 08:48:02 - nnn もちろん、100bpほどのPCR産物を直接シークエンスにかけるのではなく、 一度クローニングベクターに組み込んでシークエンスを読むという古典的な方法をとってもいいと思います。（シークエンスを読むクローン数は増えますが。）

(無題) 削除/引用 No.3030-5 - 2010/08/18 (水) 08:04:42 - nnn >そのPCRプロダクトをそのままテンプレートに使って2ndPCRを行ったところ、ウラシルDNAグリコシレース入りのUniversal master mixではバンドが見れませんでした。 これはこれで正しい結果でしょう。 考察は、2ndPCRのウラシルNグリコシラーゼが、1stPCR産物（ウラシルが含まれている）を分解している、でしょうか。 >そこでGoTaqを使いPCRを行いました。 （中略） >1stPCRですらバンドが見えず困っている、という事でした。 PCR効率が違うことに関しては、TK-1さんが書かれている通りです。 補足として、多くのqPCR用の試薬がPCR効率が高まるようにバッファーを最適化していると思います。 また、TK-1さんが仰っているように >それでポジコンではシグナルが出たんでしょうか？ 重要ですが、どうでしょうか？ ゲルから抽出したいが、シグナルが弱いということですので、 １つは、単にサイクル数を増やす（ABIのqPCR用の試薬で）。 他の方法は、1stPCRはABIのqPCR用の試薬、2ndPCRをGoTaqを使ってみる。 PCR反応液から精製する場合は、単一PCR産物の時だけです（特にSYBR Greenの系）。 今回のさつこさんの場合、ゲルから切り出したほうがシークエンスが読めると思います。 >Q社のwebサイトによると100bp以上しか精製出来ないということで、 （中略） >プライマーなどの混じり物が悪さをするでしょうか？ QIAGEN社のキットには、MinEluteカラムを使う、70bp-4kbp対応の精製キットがあります。 http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/dnacleanupsyschooser.aspx もちろんPCRのプライマー（両側とも入っている）を持ち越すとと困ります。 シークエンスは、それぞれ単独にフォワードプライマーだけ、リバースプライマーだけで、２方向から読みます。 >ちなみに、100bp程度の短いDNAのシークエンスを読むことが難しいということはわかっています。そこには敢えて触れずに、いかがでしょうか。 そうでしたね。 使っているのはABI3730とBigDye3.1です（外部委託してます）。

2nd PCR 削除/引用 No.3030-4 - 2010/08/18 (水) 06:35:15 - さつこ 御回答どうもありがとうございます。 プローブなしでPCRを走らせた後、ゲルに流してバンドを見ています。 リアルタイム用のプライマーですので、推奨されているように100bp程度のバンドを検出するため4%のゲルを使っています。 しかし、バンドが弱く、そのままではゲルからの切り出しが難しいので、そのPCRプロダクトをそのままテンプレートに使って2ndPCRを行ったところ、ウラシルDNAグリコシレース入りのUniversal master mixではバンドが見れませんでした。 そこでGoTaqを使いPCRを行いました。当然denature，anealling, extensionの条件はリアルタイムの時とは変えています。aneallingにグラディエントをかけましたが、1stPCRですらバンドが見えず困っている、という事でした。 しかし、ウラシルDNAグリコシレース入りでもシークエンスにかけられる、ということと、PCR精製キットを使っているということがヒントになりました。 Q社のwebサイトによると100bp以上しか精製出来ないということで、わたしの目的とするPCR産物はなかなか厳しいかなと思いますが、あるいはフェノール・クロロホルム抽出でDNAを精製して、それをシークエンスにかけるということは可能でしょうか。プライマーなどの混じり物が悪さをするでしょうか？ ちなみに、100bp程度の短いDNAのシークエンスを読むことが難しいということはわかっています。そこには敢えて触れずに、いかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3030-3 - 2010/08/17 (火) 07:49:32 - nnn ABIのqPCR用の試薬（SYBR Green、TaqMan共に）を使って得られたPCR産物を、Q社のPCR精製キットを使って精製した後、一般的なシークエンス反応を行いシークエンスを読んでいますが、問題無いです。 ウラシルでもシークエンスは読めますし（結果はチミンとして表示されます）、 ウラシルNグリコシラーゼは、最初の熱変性（95度、10分）のステップで失活してますし。

(無題) 削除/引用 No.3030-2 - 2010/08/17 (火) 06:56:24 - TK-1 bufferが変われば同じ酵素でも反応の仕方が変わるのは当たり前です。 というより、そもそもTaqman assay用の試薬で標識probe無しでテストをしたという用に読み取れますが、そうでしょうか。それでポジコンではシグナルが出たんでしょうか？ 本当にUDGが問題と考えているのならばUDG抜きの試薬も売っていると思いますが、UDGの試薬でも増幅があればちゃんとバンドは出ます。そうでなければUDG入りのSYBR試薬なんて成り立ちません。 もし私の解釈が正しいのであれば、いろんな試薬よりを使うより、原理を考えることに時間をかける方がよろしいかと思います。

リアルタイムPCR用プライマー 削除/引用 No.3030-1 - 2010/08/17 (火) 03:37:06 - さつこ いつも勉強させてもらっています。 最近リアルタイムPCRを始め、ABI7500を使っています。 現在ある遺伝子のリアルタイムPCRの系を確立しようとして、プライマーをプライマーエキスプレスでデザインしました。 もともと、以前いたポスドクからの流れで、プローブでの検出を行うよう指示されており、試薬もそれ用のTaqMan Universal PCR master Mixを使っています。 プローブが高いので、まずデザインしたプライマーでPCRが走るのか検出してからプローブを購入することを考えています。 そして、そのプライマーを使い上記試薬でPCRを走らせてみるとネガコンとして考えていた組織のサンプルでもバンドが見えました。（RT(-)のサンプルも使ってゲノムのコンタミは否定されています。）ネガコンとして考えていたサンプルについては文献的な情報が乏しく、本当に発現しているかもしれなと考えシークエンスを見てみようということになりました。しかし、MsterMixにウラシルDNAグリコシレースが含まれており、このPCRプロダクトでは（バンドも薄く）シークエンスを読めないだろうということで、プロメガのgoTaqを使い、通常のPCRを走らせました。アニーリングの温度も55度から62度まで条件を振りましたが、それでは全くバンドが検出されません。プライマーが悪いと思い、別のプライマー（プライマーエキスプレスでデザインしたもの）で再度試したものの、リアルタイムの系で走らせたものはそのあとゲルに流してもバンドが見えるのに、ノーマルPCRでやるとバンドが全く見えないという、同じ現象になってしまいます。 リアルタイム用とノーマル用でPCRの走りやすさなどが違うのでしょうか。 このような経験をされた方はいらっしゃいますでしょうか。解決策などありましたら御教示ください。

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