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(無題) 削除/引用 No.3029-12 - 2010/08/18 (水) 01:49:14 - masa 少し話がずれるかもしれませんがGFPはin vivoでのイメージングには不向きの場合があります。 肺を摘出して表面に腫瘍ができる位であれば十分蛍光が観察可能ですが、生きたまま表皮の上から励起させたり、肺の内部の方の細胞由来の蛍光を観察するのはマウスの自家蛍光や励起光の組織の透過率の関係から難しいようです。（某in vivoイメージングのメーカーの方がおっしゃっていました） そのような場合はRFPのような赤色蛍光の方がシグナルが強いそうです。一番感度がいいのはルシフェラーゼによる発行ですが、基質を注射したりと手間がかかるので敷居が少し高いです。 きちんと安定発現株が樹立できているのに蛍光が観察できないときは上記のような手段も参考になればと思います。 あとGFPの発現が落ちていても、肺ごとゲノムやRNAを抽出してGFPをqPCRで検出するという荒業？もあります。

(無題) 削除/引用 No.3029-11 - 2010/08/16 (月) 21:49:00 - Actias CS-CDF-CG-PRE レンチウイルスにしたわけではなくって、そのまま使ったのですか？ なんにしても、B16の動態を観察するのだから、stable cell line を確立してからでないと。 マップを見ると、NotI で直鎖化できそうなので、このベクターでもstable cell line が取れそうな気がしますが。 その辺の戦略は、先輩なり先生と相談してね。

(無題) 削除/引用 No.3029-10 - 2010/08/16 (月) 21:45:52 - stu CS-CDF-CG-PREってレンチウイルスのベクターですよね。 ということは、その先輩はレンチウイルスでstable GFP発現株を作ったけど、in vivoで発現が消えてしまった。よって次はpcDNA3に入れて、トランスフェクションによってより高い発現のstable GFP発現株を作って、挑戦ということでしょうか？ 他の方もすでにおっしゃっておりますが、pcDNA３にGFP発現カセットを２つ入れても、そもそもstableになる細胞というのはいくつものプラスミドが入っているものです。だからpcDNA3にGFPカセットを２つ入れても意味がありません。プラスミドが長くなりトランスフェクション効率が下がるだけです。結局はプラスミドが多く入った細胞がGFP発現高いからです。 一応確認しておきますが、その先輩が言うin vivoでの発現がなかったというのは、ちゃんとGFPの蛍光を保てる条件で固定、観察したのですよね。 なんだか、発現量が問題というよりも、GFPが見えるか見えないかの問題のようなので、とりあえず私なら、 １、その組織をGFP抗体で染色して発現を確認する。GFPが蛍光で見える量というのは、それなりの発現が必要ですが（特に組織の場合は自家蛍光とかぶってわかりにくくなる）、抗体で染めれば実は発現しているということがあります。 それがダメなら、 ２、pcDNA3にGFPを入れて（GFPは一つで十分）、トランスフェクションの条件検討後、最も導入効率の良い方法でstable GFP発現株をセレクション、単離する。 でしょうか。 ここまで書いて思ったのですが、レンチウイルスでちゃんと発現させたのに、そもそもin vivoでGFP発現が消えてしまうのであれば、そのin vivoでの問題を一番解決しないといけないような気がしますけど。

(無題) 削除/引用 No.3029-9 - 2010/08/16 (月) 20:49:46 - ami 【補足】 Cell SortingはFACSを使います。 あと、GFPってEGFPですよね。B16だと意外と繊細だからGFPだとまずいかも、、EGFPならいいのかなぁ、、 Human CD2とかじゃだめですか。

こうする案 削除/引用 No.3029-8 - 2010/08/16 (月) 20:45:51 - ami とりあえず今のGFPベクターをTransfection ↓ 薬剤選択とかせずにしばらく適当放置 ↓ GFPの発現がめっちゃ高いやつだけCell Sorting いかがでしょうか。

補足です。 削除/引用 No.3029-7 - 2010/08/16 (月) 18:03:46 - 素人学生 コメントありがとうございます。 permanent cell lineとは、stable cell lineと同じようなものでしょうか？私は、FuGENE6で細胞に導入してから薬剤セレクションをしようと考えています。 また、プロモーターの検討も行いたいと思います。 先輩の行った実験では、細胞レベルでは発現しているのですがin vivo では発現が弱く、GFPがほとんど確認できなかったそうです。また、先輩が使用したのはCS-CDF-CG-PREです。 polyAだけでなく、1セットにしてPCRを行う方法は魅力的なので行ってみようと思います。 GFP以外の蛍光色素ですね。マウスの肺で発現した場合に、どの色の色素が一番見やすいのかご存知でしょうか？ よろしくご教授ください。

(無題) 削除/引用 No.3029-6 - 2010/08/16 (月) 17:24:00 - Boston より蛍光の強い YFP を使うのも手だと思います。

(無題) 削除/引用 No.3029-5 - 2010/08/16 (月) 17:10:59 - 774 GFPの発現が観察できなかったとのことですが、これはtransfectionした細胞を顕微鏡で見た場合のことでしょうか？ それとも細胞レベルでは発現してるのに、個体でのin vivo imagingで観察できなかったのでしょうか？ 発現量が理由であれば、その細胞で転写活性が高いことがわかっているorメチル化等による転写抑制が起こりにくいプロモーターに換えると発現が上がるかもしれません。具体的には存じ上げませんが。 pAをPCRしてライゲーションするより、1セットまとめてPCRして組み込んだ方が楽にサブクローニングできるかと思います。 ただ、プロモーター・遺伝子・pAを2セット繋ぐと、プラスミド内での組み換えが起こりやすくなりそうな気がします。

(無題) 削除/引用 No.3029-4 - 2010/08/16 (月) 17:09:37 - Ｔ permanent cell line を作るんですよね？ それなら放っておいても普通は複数コピーのプラスミドがゲノムに入るので、特にタンデムインサートのプラスミドを作るメリットはないと思いますが。 発現量の高い細胞をクローニングすればいいだけですよ。 あとは B16 がどうかは知りませんが、CMV が常に最強のプロモーターというわけではありません。細胞種によっては別のプロモーターの方が発現がダントツに高い場合もあります。

(無題) 削除/引用 No.3029-3 - 2010/08/16 (月) 16:51:14 - 素人学生 コメントありがとうございます。 タンデムの方法ではなく、プロモーターとGFPを2つ加えようと考えていたのでPolyAは2つ必要なのですね。 細胞への導入は、FuGENE6の使用を考えていました。培養の条件などはまだ検討中です。 勉強不足で申し訳ないのですが、PolyAはPCRで増幅してライゲーションすればよろしいのでしょうか？ また、2-4xGFPの酵母の場合、発現量は増えていたのでしょうか？ よろしくご教授ください。

(無題) 削除/引用 No.3029-2 - 2010/08/16 (月) 16:03:21 - stu ２つのGFPをタンデムにつなげて発現させることが目的なのであれば、pAは一つです。プロモーターGFPpAを一つのカセットと考えているのならpAは２ついることになります。 ただ 酵母では確かに2-4xGFPというものを見たことありますが、培養細胞では見たことありません。 そもそも発現タンパク質やベクターが大きくなるほど発現効率や導入効率は下がりますし、もしうまくいって２倍発現したとしても、蛍光量が２倍というのはそれほど劇的に明るく見えるわけではありませんよ。 可能な限り高い発現がほしいのであれば、ベクターを変えたり、導入の方法（トランスフェクション、ウイルス感染）、条件などを検討したほうがよいように思います。

GFP発現ベクターの強化について 削除/引用 No.3029-1 - 2010/08/16 (月) 13:39:21 - 素人学生 大学４年生でベクター作成をしています。 マウスのメラノーマ細胞（B16）にGFP発現ベクターを導入し、メラノーマの転移を観察することを目標にしています。 過去に先輩方が作成したGFP発現ベクターでは、GFPの発現量が少なく十分な観察が困難であった為、pcDNA3.1というベクターにGFPの発現カセットを2つ入れたベクターの作成を考えています。 この時、GFP発現カセットが2つあるのでそれぞれにPolyAは必要なのでしょうか？ また、他にGFPの発現量を増やす良い方法がございましたら教えてください。 よろしくご教授ください。

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