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(無題) 削除/引用 No.3025-8 - 2010/08/15 (日) 21:10:56 - Boston > 　これはスレオニンでもリン酸化されるはずだから、さきほどの結果がアーティファクトではないことの証明ということでしょうか？ アーチファクトでないとまでは言えませんが、少なくともセリン、スレオニンであることが結合に重要であることは言えます。 WT と mutant を免沈して、結合タンパク質のパターンに変化があるか銀染で確認してみては？脱リン酸化酵素がアスパラギン酸 mutant に結合して、B との結合を阻害している可能性は大です。だから、アラニン mutant と区別がつかなかったのかも知れません。あくまで、リン酸化が B との結合を促進するとした場合の話ですが。

(無題) 削除/引用 No.3025-7 - 2010/08/15 (日) 19:10:22 - aileron Boston様 　返信ありがとうございます。 >スレオニンで結合するか試して見る必要があるかと思います。 　これはスレオニンでもリン酸化されるはずだから、さきほどの結果がアーティファクトではないことの証明ということでしょうか？ >そのリン酸化部位は種を超えて保存されていますか？ 少なくとも脊椎動物の中では保存されています。 >B を免沈して、結合した A がリン酸化されているかを確認するシステムを持っていますか？ 残念ながらリン酸化特異抗体を持っていないので、SDS-PAGEの移動度で見極めるしかありません。

(無題) 削除/引用 No.3025-6 - 2010/08/15 (日) 10:34:11 - Boston スレオニンで結合するか試して見る必要があるかと思います。あと、脱リン酸化酵素が結合してしまって、B との結合を競合的に阻害している可能性もあります。諦めるには早いです。 ちなみに、そのリン酸化部位は種を超えて保存されていますか？B を免沈して、結合した A がリン酸化されているかを確認するシステムを持っていますか？

(無題) 削除/引用 No.3025-5 - 2010/08/14 (土) 23:40:44 - aileron 　実は、リン酸化によって結合能が変化し、どちらかのフォームに特異的だとすると、今考えてるストーリーと良く合うので、かなり知りたいところだったのです。 　リン酸化をミミックするときは、アスパラギン酸だけでなく、グルタミン酸も試したほうが良いですか？ どちらが良いかはタンパクによりますか？ 私の指導教官は、リン酸化セリンはアスパラギン酸の方が似ているので、アスパラギン酸が良いと言っていたのですが。どうなんでしょう？

(無題) 削除/引用 No.3025-4 - 2010/08/14 (土) 23:00:07 - うーん >どんなときにうまくいかなかったのか、ご存知であれば教えてください。 これはタンパク質によりけりです。 ミミックが上手くいく場合もあれば、トピ主さんのように期待した効果が得られなかったりもしました。その件に関してはmutantは色々作りましたね。そのリン酸化セリン周辺のアミノ酸をいじってリン酸化に必要なコンセンサス配列を崩してみたりなど。 いずれにしてもトピ主さんの場合、そのアミノ酸の変異１つで結合が低下することは事実ですので、あまりアスパラギン酸でミミックがかからないことにそれほど悩むこともないかなと。

(無題) 削除/引用 No.3025-3 - 2010/08/14 (土) 22:53:46 - aileron うーん様 　早速の返信、ありがとうございます。 >アスパラギン酸はリン酸化ミミックを期待して入れてるんですよね？ 　はい、それを期待していました。 　当初、リン酸化フォームでは結合が阻害され、リン酸化されていない状態で結合するのを期待していました。 　しかし、どちらともで結合が阻害されてしまい。。。 　 >リン酸化ミミックはうまく行かない場合もあるので。 　どんなときにうまくいかなかったのか、ご存知であれば教えてください。 >eletion mutantなども含めてもういくつかのmutant作りをしてみてもいいかもしれませんね。 Aのdetion mutantに関しては既にやっていて、Aの結合領域全体が必要だということがわかっています。あと行うとしたら、どのようなmutantが考えられるでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3025-2 - 2010/08/14 (土) 20:50:20 - うーん アスパラギン酸はリン酸化ミミックを期待して入れてるんですよね？ リン酸化ミミックはうまく行かない場合もあるので、アーティファクトと考えるのはまだ早いかなと思います。deletion mutantなども含めてもういくつかのmutant作りをしてみてもいいかもしれませんね。

リン酸化部位の変異とタンパク結合との関係 削除/引用 No.3025-1 - 2010/08/14 (土) 19:35:02 - aileron 日本の大学院生です。 今、蛋白質AとBの間の結合を、免疫沈降法を使って調べています。 最近、Aの結合部位にリン酸化修飾されるセリンが見つかりました。 そこで、Bとの結合に影響があるかどうか調べるため、セリンをアラニンもしくはアスパラギン酸に置換した変異体を作製して、免疫沈降を行いました。 その結果、アラニン、アスパラギン酸両方の変異体で、野生型より結合能が低下していました。（低下の具合は両方で同じくらいでした） この結果は単にリン酸化とは関係なしに変異を入れたことによるアーティファクトなのでしょうか？ 少し、教えていただけたらと思います、よろしくお願いします。

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