BioTechnicalフォーラム [プラスミドの大量精製の収量低下]

(無題)

No.3023-17 - 2010/08/20 (金) 03:38:12 - RFP融合タンパク質

さまざまな方のアドバイスにより解決しました。

効果的な対策としては、

１．容量を容器の1/3程度以下にしてエアレーション効率を高くする。
２．抗生物質の濃度を上げる。
３．容量を増やし、アルカリSDS後にisopropanolでDNAを沈殿濃縮する。

以上によって、精製途中ですが、
プラスミドの沈殿物が見た目、2倍程度、多くなりました。

カラム以外の試薬は自前で調整できそうですので、
節約にもなり、助かりました。

ありがとうございました。

(無題)

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No.3023-16 - 2010/08/16 (月) 16:09:53 - 中年

エアレーションは今回に限らず徹底した方が良いと思います。また、先の回答にも書きましたが、培養時間12時間というのは、一般的には短すぎると思います（お使いのキットでその条件が推奨されているなら別ですが）。

毒性があってプラスミドの収量が低いというのは良くあることです。その場合は、コピー数が下がるというよりプラスミドを脱落させた菌が優先的に増えることで収量が落ちます。アンピシリンを補うというのはそれを防ぐためですが、アンピシリン耐性遺伝子のコードするβ-ラクタマーゼは分泌性の酵素で、菌が生え出した後に加えたアンピシリンはたちまち分解されてしまいますので、手間ですが遠心で一度菌体を回収して新しいアンピシリン入りの培地に再懸濁した方が有効だと思います。

現状で一番簡単に収量を上げるには、bさんがお書きになっているように３倍量の培養からアルカリ法でプラスミドを回収し（ProKやPhOH-CHCl3抽出は不要）、それをTEなどに再溶解したものを再度キットに沿って処理してカラムに掛けることで、この方法はQiagenのマニュアルに記載があったと思います。

(無題)

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No.3023-15 - 2010/08/15 (日) 22:25:18 - RFP融合タンパク質

さまざまな、ご助言ありがとうございます。

対応策として、総合しますと、

１．１Lフラスコで200mL程度に下げ、エアレーション効率を上げる。
　(残念ながら、回転数200rpmの性能のものは身近にないですが)
２．アンピシリンを1時間ごとに追加する。
３．おまじないでグルコースを1％入れてみる。
４．ProKでタンパク質を分解させて詰まりを防止する。
　　(アルカリSDS後の上清に加えるのが効果的？さらに５．を行う)
５．アルカリSDS後の上清にisopropanolを添加して遠心で、
　　濃縮と余剰タンパク質や脂質の除去。
(アルカリSDS後の上清にフェノクロで除タンパクも考えたことがあります)
６．3倍量スケールなら、フィルターを使用(コストも考えて検討します)

今回のタンパク質は毒性を持ち、プラスミド複製低下をさせていると思えてきました。

いろいろな方のアドバイスを参考にさせて頂き、現状に見合った条件検討してみます。自分では見落としがちな助言に触れ、助かります。ありごとうございます。

(無題)

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No.3023-14 - 2010/08/14 (土) 17:17:51 - NEKO

RFPとRFP融合タンパク質のプラスミドが同じように増えないとのことですが、融合タンパク質によっては、十分にありえることです。例えば、融合タンパク質が大きければ、増えにくい傾向にあります。毒性についても考えなくてはいけません。改善策を一つ示します。RFPと同等の収量は得られないと思いますが、大腸菌を培養する際、1時間ごとにアンピシリンを追加すると、収量が多少改善されるかもしれません。これを行う際、大腸菌のクローンから増やして、MaxiPrepにもって行って下さい。Maxiを行う前に、MiniPrepで収量を確認すると無難です。今回の場合、私でしたら、RFP単独と同じくらいの収量を得ることは期待出来ないものと考えて、実験を進めますが（良くあることなので）。

(無題)

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No.3023-13 - 2010/08/14 (土) 09:53:09 - Actias

グルコースのおまじないは、lac オペロンです。
この状況がどういうことか分からないので、「おまじない」です。

理論的にはグルコース代謝系がどうのこうの．．．と、教科書に載ってますし、「pcDNA3.1(-) なのにナニ言ってんだ」という反論もあるとは思いますが、とにかく状況が分からないので、「おまじない」で入れてはどうか、と言う提案です。

私は手取り＋超遠心派なので、カラムのことは分かりませんが、手取り+ RNase + proK で抽出してカラムにかけてはダメですか？そこまでしておけば、カラムが１本でもつまりにくいと思うのですが。

(無題)

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No.3023-12 - 2010/08/14 (土) 08:23:46 - nnn

CMVプロモーターとT7プロモーター、DH5aとHB101では働かないような・・・
個人的には、得られた菌体の色がRFPによるものとは思えないのですがね。
（プラスミド溶液だけを2mLのLB培地に入れて、無菌であるか確かめられても。）

ザンギさんとbさんが仰っているように、
1Lのフラスコに500mLの培地は多いと思います。
1Lでしたら200mLの培地、500mLフラスコなら100mLの培地くらいが適量と思います。

もし目的のタンパク質をコードする配列がベクター側に偶然似たような配列があり、
ベクター内での組み換えがおこりpUR oriやAmpRが除かれてしまう場合、
STBLシリーズやSUREシリーズの大腸菌を使うとうまくいく場合もあります。

(無題)

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No.3023-11 - 2010/08/14 (土) 05:16:03 - b

実際の原因はわかりませんので、コピー数が多い場合と少ない場合の対処法としてご参考までに。

Qiagenのトラブルシューティングに載っていますが、菌体量に対してlysis bufferの量が少ないと収量が減るようです。500 mlで培養しているので、おそらくlow copy numberのplasmidとして処理していると思いますが、RFPの発現量が増加していることを考えると、plasmid自体が増えている可能性も考えられます。一度200 mlくらいで試されてもよいかもしれません。

また、これもQiagenのプロトコールからですが、コピー数が少ない場合、あるいはアルカリSDS後のplasmidの量が少ない場合は、アルカリSDSで清浄化した上清にisopropanolを添加して遠心し、濃縮と余剰タンパク質や脂質の除去が可能のようです。溶菌に使う試薬は自前で調製できるので、3倍で培養しても1本のカラムで精製でき、コスト面での心配はないと思います。

また、3倍量の培地を使用するとカラムが詰まるということですが、清浄化はフィルターをお使いでしょうか？大腸菌量が多い、あるいは遠心による清浄化では、詰まる可能性が高くなると思います。lysis bufferあたりの大腸菌量を減らすか、フィルターを用いれば改善できるように感じます。

他のメーカーのキットを使用していても、応用は可能だと思います。

(無題)

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No.3023-10 - 2010/08/14 (土) 03:17:33 - ザンギ

> フラスコ１L(それ以上の大きさのフラスコが手持ちにないのもあります)、170rpmで行ってますが、
> RFP単独ではDNA量は500ug程度は精製できていますので、
> エアレーション不足でもないと思います。
>

過去ログにもあるかと思いますが、通常は容器の1/3程度が限界ではないで
しょうか。
500mlフラスコに150mL培養すれば、pcDNAなら通常はそれ以上の収量がある
と思います。さらに1/3となるとプラスミドの純度が心配になるレベルで
すね。
液量を減らして回転数を上げてみてください。
国産のシェーカーだと200rpm以上回せるものが少ないですが、可能な限り
高速回転すると液面の面積が増えるのでエアレーションも改善しますよ。

(無題)

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No.3023-8 - 2010/08/14 (土) 00:11:06 - RFP融合タンパク質

多方面の方から、コメントいただきありがとうございます。

> あまり考えたくは無いですが、RFPのリークではなくて、
> 酵母かなにかがコンタミしているとか？

GFP単独で、同条件ではピンク色にならないので、
RFP由来で、コンタミではないと思います。
培養時間が長いと紅芋っぽい色になります。

> あと、500mLものLB培地で培養していますが、
> どのくらいの大きさのフラスコを使っていますか？
> （エアレーション不足？？）

フラスコ１L(それ以上の大きさのフラスコが手持ちにないのもあります)、170rpmで行ってますが、
RFP単独ではDNA量は500ug程度は精製できていますので、
エアレーション不足でもないと思います。

タンパク質の発現を抑えて、
大腸菌を大量培養する方法はありますでしょうか？

(無題)

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No.3023-7 - 2010/08/13 (金) 23:46:54 - nnn

>大腸菌の沈殿物がピンク色

あまり考えたくは無いですが、RFPのリークではなくて、
酵母かなにかがコンタミしているとか？

あと、500mLものLB培地で培養していますが、
どのくらいの大きさのフラスコを使っていますか？
（エアレーション不足？？）

（ pcDNA3.1(-) のoriは、pUR oriですね。）

補足いたします

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No.3023-4 - 2010/08/13 (金) 20:26:56 - RFP融合タンパク質

コメントありがとうございます。

補足いたします。

収量はDNAの収量です。
使用ベクターはpcDNA3.1(-)
f1 ori

集菌量は、RFP単独、目的タンパク質C/N末RFP融合タンパク質で
遠心で回収した沈殿物では、ほとんど差がないように見えます。

集菌量が同程度なので、毒性というよりは、プラスミド複製が低下しているのかもしれません。

培養時間を延ばしたほうが、目的タンパク質C/N末RFP融合タンパク質由来のピンク色が濃くなり、回収DNA量が減量しています。
RFP単独ではうっすらとピンク色になる程度です。

現在、3倍量程度で行っていますが、
Max Prepも3倍量使用するので、C/N末分で、x6倍の消費になるので、
節約したい思っています(3回分をまとめて1カラムに通すと、流速が非常に遅延)。

グルコースを１％のおまじないはどのような効果が期待できますか？

(無題)

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No.3023-3 - 2010/08/13 (金) 19:51:07 - Actias

大腸菌の収量はどうですか、というのは中年さんと同じ質問。
どの段階で少ないのですか？
2 ml 培養とかでも少ないのですか？大量培養の液を2 ml 分取して、ミニプレップすると、2 ml 培養と比べて少ないですか？

ベクターはなんですか？Ori は？EM7とかの微生物用プロモーターが入っていませんか？

多分哺乳動物培養細胞用の発現ベクターだと思いますが、そもそも、何で元ベクターでもれ発現が無くて、目的タンパクのだともれるのか、わからん。

グルコースを１％くらい、おまじないで入れてみますか？

１／３なら、中年さんのおっしゃるとおり、３倍やるか３回やればいいと思いますが。

(無題)

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No.3023-2 - 2010/08/13 (金) 18:40:41 - 中年

集菌時の菌体量はRFP単独の場合に比べて少ないんですか？それとも差はないのですか。菌体量が少ないなら培養時間を延ばしてみては（植菌量にも依りますが12時間は短い気がします。マニュアルにはそうしろとありましたか？）。そうでなくとも、単に培養スケールを３倍にすれば良いように思いますが。

プラスミドの大量精製の収量低下

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No.3023-1 - 2010/08/13 (金) 17:05:27 - RFP融合タンパク質

お世話になっております。

カスパーゼ切断部位と核移行シグナルのあるタンパク質の
N末、C末それぞれにRFPを付加した融合タンパク質の
プラスミドの大量精製(Max Prep)を行ったところ、

RFP単独では、収量はマニュアル通りになるのですが、
C末付加RFPやN末付加の融合タンパク質では収量が1/3以下になります。
Amp、LB、500mLで、37℃で一晩(12時間程度)で培養しています。

目的タンパク質のC末にRFPを融合した場合、大腸菌の沈殿物がピンク色になっています。たぶん、RFPの色と思われます。
ベクターを変えても同じことが起きます。

目的タンパク質が大腸菌に毒性があるように思えますが、

プラスミド大量精製の収量の低下を防ぐ(収量増加)には
どのような方法がありますでしょうか？

たとえば、
温度を何度ぐらいに下げる？
その時の大腸菌培養時間
など
対処法をご存知の方、教えていただきますと助かります。
よろしくお願い致します。