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(無題) 削除/引用 No.302-7 - 2009/04/14 (火) 00:27:33 - A 扱っているDNA結合蛋白質がDEAEの様な陰イオン交換カラムに着かない のであれば精製の初期段階で硫安沈殿の後、陰イオン交換カラムを通せば ほとんどのDNAを除けるはずです。硫安沈殿だけでもかなり除けるはずです。 それが使えないなら今分かってるその蛋白質に最も強く結合できるDNA配列 を使ったDNAカラムをにつけて精製すればDNAのコンタミを除けるでしょうね。このカラムは高くつきそうですが。 以前近くに転写因子の結晶構造解析をしているラボがあってそこでは上に 示したような初期過程を経てその後いろいろなカラムを使って最終的に 精製された蛋白質に合成DNAを混ぜて（混合条件はゲルシフトアッセイで 決めてたかな？）、ゲルろ過で複合体を単体を分離した後に結晶化して ました。もし微妙にDNAのコンタミがあってもこの段階でより強く結合 できる合成DNA配列に置き換わっているのかもしれません。DNAとの結合は 結局平衡状態にありますから。 >DNAをむりくり剥がす方向に考えるのではなく、DNAが結合していても同一の>ものにする方向で考えようかとも思いました。 これはやめたほうがいいと思います。今扱っているDNA結合蛋白質が どのようなDNA配列に結合できることが分かっているのか知りませんが 通常このような蛋白質が結合できるDNA配列には基本的な相同性が あるもののたった一つの配列ということはありませんから。DNAの 配列が違えばDNAの構造も違いますし、DNA配列が違えば蛋白質側の 構造も微妙に変わりますからこの方法だと結晶化がうまく行かない 可能性があります。

(無題) 削除/引用 No.302-6 - 2009/04/12 (日) 14:19:30 - るる DNase�Tやマイクロコッカルヌクレアーゼを用いれば、DNAがあったとしても同じくらいの大きさのDNAがくっついているわけだから単一に近くなる！ というわけですね。 文献を見てみると、タンパク質とDNAを別々に精製したものを結合させて結晶構造解析を行っている人たちがいたので、DNAが結合していても、同一のものであれば、結晶構造解析できるみたいです。 なので、DNAをむりくり剥がす方向に考えるのではなく、DNAが結合していても同一のものにする方向で考えようかとも思いました。

(無題) 削除/引用 No.302-5 - 2009/04/11 (土) 15:27:51 - 名無し ハイパートニックは高い塩濃度のバッファーという意味です。DNAと蛋白質のイオン的なインターラクションを弱めることが期待できます。DNaseはいろいろあるとおもうのですが、マイクロコッカルヌクレアーゼはヌクレオソームとヌクレオソームの間のリンカーの辺を好んで切ります。つまりDNA-蛋白質複合体はヌクレオソーム単位でバラバラになります。DNase I はヌクレオソーム部分で蛋白質からすこし離れてループみたいになってる部分を好んで切ります。クロマチンの研究などではこの違いをうまく使い分けて実験系をくむ事もあるみたいです。 いずれにせよ蛋白質と接触している部分のDNAはプロテクトされてヌクレアーゼから守られると思いますので精製物にあるDNAの多くはそういうものかもしれません。超音波だといろんな長さのDNA断片がくっついている可能性があり、（原因がDNAならばという仮定ですが）結果としてスメアーになったのかなあと思います。酵素なら決まった場所でもう少しきちっと切れるのでDNA-proteinのヘテロジェネチィーはもうすこし少なくなるのではないかと思います。。あと膵臓由来のヌクレアーゼはトリプシンが混じっている可能性があり蛋白質の実験には使えないというということで、マイクロコッカルヌクレアーゼやリコンビナントのDNase Iを選ぶということもあります。 ネーティブPAGEだと蛋白質自身の荷電状態も移動度に大きな影響を与えますね。リン酸化とかアセチル化とか荷電をもつようなアミノ酸残基の修飾があって分子のヘテロジェネティーが増した結果という可能性も考えられるように思います。このような修飾は分子量変化は僅かですから、（リン酸化などでは注意して電気泳動するとダブレットバンドが見える場合はあるかもしれませんが）多くの場合SDS-PAGEでは移動度からの識別は困難でしょう。

(無題) 削除/引用 No.302-4 - 2009/04/11 (土) 11:09:31 - るる コメントありがとうございます！！ ＞おおさん なるほど◎ 260と280nmのOD値を見る＆Native PAGEで流したものをエチプロ検出はすぐにできそうなので、やってみたいと思います。ただ問題は、量的に検出できるどうかというところでしょうか。 そうですねぇ…ひとまず精製後か細胞を壊すときにDNase処理を入れてみることにします！ ＞名無しさん 細胞のpellet 　↓←lysis buffer 30min on ice 　↓ sonication（膜、DNAを壊す） という順序で、今はDNaseは使っていません。次回はsonication前にDNase処理をしてみようかな、と思います。 ところで…ハイパートニックbufferやマイクロコッカルヌクレアーゼはどういうものなのでしょうか？？良かったら教えてください。 あと、SDS-PAGEではキレイな１本のバンドになっています！

(無題) 削除/引用 No.302-3 - 2009/04/11 (土) 00:51:24 - 名無し ハイパートニックbuffer使うとか、DNase 処理とか超音波とかでDNAをある程度切るとかしてから精製をしてるのでしょうか？もしされているならばDNase Iとマイクロコッカルヌクレアーゼ両方使われているのでしょうか。切れ方が不完全だといろんな長さのDNAがくっついた状態なのでスメアになるかも？とか思いました。もし特にしていないならば長いDNAに結合したままで蛋白質を精製できるのだろうか？と不思議に思いました。あといろんな蛋白質とくっついてたりしませんか？SDS-PAGEではシングルバンドですか？

(無題) 削除/引用 No.302-2 - 2009/04/10 (金) 14:10:52 - おお まず精製したタンパクの260と280nmのOD値を見てみるといいかとおもいます。 精製したものをNative PAGEで流しエチプロで検出できるかもしれません。 精製したものをDNase処理してから流すとスメアーがシャープになったりしませんでしょうか。 さて完全にDNAをはがす方法ですが、うーん塩濃度上げたりするくらいしか 思いつきません。DNaseしょりは、DNAに切れ目を入れることで、 タンパクの結合を不安定にすることはできると思いますので、 処理しても良いかと思います。 DNAが結合する可能性があるなら、RNAも結合する場合もあるかもしれない ということを頭の片隅に置いておいた方がいいかもしれません。

DNA結合タンパク質の精製について！！！ 削除/引用 No.302-1 - 2009/04/10 (金) 10:02:46 - るる 今DNA結合タンパクの精製を行っているのですが、 精製してきたタンパクにDNAが結合しているかどうか確める方法はありますでしょうか？ 今の状態は、精製したものをNative PAGEで流すとスメアーになってしまうので、DNAの結合を疑っています。 また、最終的には結晶構造解析にもっていきたいので、タンパクからDNAをはがす方法などなどご存知の方いらっしゃったら教えてください！ lysisした後にDNaseを加えただけではダメですよね…！？

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