ルシフェラーゼアッセイの発光について教えてください。
「96well plateを用いて測定をしていますが、プロモータと試薬の組み合わせにより、plateの最初から最後にかけて発光が次第に低下します。」
実験の概略ですが、Gaussiaを用いたルシフェラーゼアッセイで、インフェクション数日後に薬剤を撒き、96well plateに上清を25μLずつとり、基質は測定器が測定開始直前に自動的に1well毎に混入し、発光を測定しています。つまり、基質とサンプルの混入はいずれのwellも同じタイミングです。
現在、2種類のプロモーターと2種類の試薬を試しています。仮に、プロモーターはAとBがあり、試薬は1と2があるとします。Aと1，Aと2，Bと1の組み合わせで、発光をチェックした際は、理にかなった結果が得られますが、Bと2の組み合わせを用いた場合、96wellの最初と最後で発光が1/5くらいに低下します。
基質の調整法は同じ方法で、何度試しても同じ結果が得られます。96well全てに同じサンプルを入れてみましたが，次第に発光が低下します。試しに、同じ96well plateにAと2の組み合わせ、Bと2の組み合わせの両方を入れたりもしましたが、Bと2の組み合わせのものだけが、発光が低下していきます。プロモーターと薬剤の組み合わせで、このようなトラブルが起こるのでしょうか？
以前に、Metridiaを用いたルシフェラーゼアッセイを行ったことがありましたが、この場合は、どの組み合わせを用いても発光が低下するといったトラブルがあり諦めました。
どなたか、ご存知の方がいらっしゃいましたら教えていただけないでしょうか。 |
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