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DCのフローサイトメトリー トピック削除
No.3014-TOPIC - 2010/08/11 (水) 17:53:00 - 大根
研究初心者の大学院生です。
現在、ヒト末梢血からimmatureなmonocyte derived DCを培養した細胞のフローサイトメトリーに難渋しております。
DCは大きいので、通常の初期設定(末梢血の解析時)で外に大きく外れるくらいにあるpopulationだと考えているのですが、それがDCのpopulationと考えてよいのでしょうか？もしくは、それはゴミとして無視してよいのでしょうか？前者の場合、まず最初に末梢血の解析時よりvoltageを下げる必要があると思いますが、この時にFSCとSSCだけ下げるべきか、FL1,2,3も下げるべきなのか、自分でどう調整してもうまくいきません。どのように調整すればよいのでしょうか？もし、一般的な目安値があるようなら併せて教えて頂ければ幸いです。
　
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No.3014-6 - 2010/08/13 (金) 08:31:25 - 大根
DCはCD14をMACSで分離し、IL-4,GM-CSFで培養しております。
死細胞除去にはDead cell removerを用いるとMACSが2重になってしまいできないかと思っていましたが、PIを用いる方法があったのですね。知りませんでした。使ってみたいと思います。
ありがとうございました。

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No.3014-5 - 2010/08/12 (木) 17:33:46 - DC
なんか、まさかの御指名があったので・・・
MoDCのFACSであればまずCD14 (+) monocyteを精製する所から始めていると思います。
文献などでよく見かける分化誘導方法を用いれば、大抵は誘導完了日（通常は6〜8日）ではPopulationは大きなもの一つになっていると思います。
（ありえないとは思いますが、もしPBMCからMonocyte精製かまさずに分化誘導かけた場合は、もっとヘテロなPopulationが多くなると思いますのでFACSでのFSC/SSCゲーティングが慣れていないと不自由するかもしれません）

それから、分化誘導をした場合ではそれなりの長期間培養しているわけですし、ある程度死細胞が出現しますので、PIなどで死細胞をゲートアウトするのをお勧めします。FACSシリーズであればPIはFL2かFL3で検出可能です。
FSC/SSC及びCompensationについてはamiさんと全く同意見です。

分化誘導かけた細胞を初めてFACSかける時は結構驚くような所に目的の細胞集団があったりします。ある程度多めに細胞を調製して、FACSの前で色々遊んでみてください。

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No.3014-4 - 2010/08/12 (木) 16:10:30 - 大根
ご助言、ありがとうございました。
populationからあたりをつけるという出だしから間違って
いたようですね。
3colorしかできない機械ですので、目的の染色をする前に
まず、DCを同定する染色パターンで解析してみます。
そこからやり直します。

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No.3014-3 - 2010/08/11 (水) 23:10:40 - ami
ぶっは。

【DCのゲーティング】
どちらをDCと考えるかではなくて、どちらかちゃんと科学的に同定してください。DC特異的に染まる抗体があればベストですが、誘導をかけてない細胞を用意してもいいです。

【蛍光感度の調整】
FL1,2,3は機械によって数字が全然ちがいます。染色をしてない細胞か、Isotype抗体で染めた細胞を用いて、それでシグナルが低い位置に出るような感度に設定します。

【Compensationの調整】
初めて染める細胞であれば、複数の蛍光色素で染めているのであれば、Compensationの調整用に、それぞれ１つだけの蛍光色素で染めたサンプルを用意する必要があります。

【小言】
初めてやる実験は、成書を読んだ方が結局早かったりします。

(無題) 削除/引用
No.3014-2 - 2010/08/11 (水) 21:57:55 - うーん
私はDCのpopulationをみたことはありませんが、私ならきっとこうします。

まず、サンプルをDC特異的に染め分ける事ができる抗体（緑色蛍光色素）で染色
↓
no gateのままで、FL-1のhistogramを見て、蛍光が陽性のところにリージョンR1を作ります。
↓
no gateをR1に変更し、FSC/SSC dot plotを眺め、蛍光陽性細胞（DC）のpopulationがどこにいるかを見つけます。
↓
で、改めてDot plot上にゲートR2を作製します。
↓
R1をR2に変更し、データ取得を試みます。

てな具合なんでしょうか。。
DCさんやamiさんがきっといいアドバイスを書いてくださるとは思いますのでそれを期待しましょう、、

DCのフローサイトメトリー 削除/引用
No.3014-1 - 2010/08/11 (水) 17:53:00 - 大根
研究初心者の大学院生です。
現在、ヒト末梢血からimmatureなmonocyte derived DCを培養した細胞のフローサイトメトリーに難渋しております。
DCは大きいので、通常の初期設定(末梢血の解析時)で外に大きく外れるくらいにあるpopulationだと考えているのですが、それがDCのpopulationと考えてよいのでしょうか？もしくは、それはゴミとして無視してよいのでしょうか？前者の場合、まず最初に末梢血の解析時よりvoltageを下げる必要があると思いますが、この時にFSCとSSCだけ下げるべきか、FL1,2,3も下げるべきなのか、自分でどう調整してもうまくいきません。どのように調整すればよいのでしょうか？もし、一般的な目安値があるようなら併せて教えて頂ければ幸いです。
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