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(無題) 削除/引用 No.3007-11 - 2010/08/21 (土) 17:17:00 - DC NaiveマウスのSpleenをP+IでO/N刺激後、IL-17のICSを行なった事がありますが、この時はしっかりDetectできた、という経験があります。 黒齣さんの系ではP+Iは４時間刺激だったために刺激が十分入らなかったのでは？ FACSでのICSは感度がとても低い（ICS < ELISA < ELISPOTと聞いた事があります）ので、刺激はしっかり入れておいた方がいいかと。 ベストはTCR Tgマウスが使える事なんですけどね。 メーカーのDSに記載されているポジコンの調製方法や染色方法はとても簡略化されていると考えた方がいいでしょうね・・・細胞名や組織名を参考にする程度に私はしています。

(無題) 削除/引用 No.3007-10 - 2010/08/21 (土) 05:10:02 - TK-1 spleen T cellをex vivoで刺激して染めても大した数のcytokine陽性細胞は出てこないと思います。CD8なら10-20%程度のIFNg(+)細胞は見られると思いますが、 CD4なら数％見られればいい方でしょうし、B6を使っていればIL4(+)はまず見えないものだと思ってください。 mesenteric LNならすう％のIL17(+)細胞は見られるかもしれません。胸腺ではごく少数のgdT cellやNKT cellsでこれらのサイトカインの産生が見られるかもしれません。 いずれにせよ、こういった細胞は自己抗原や過去の外来性抗原（腸管などで）を経験したものがmemoryとして残っているものなので、その条件がわからなければどこまできっちりとした結論が導きだせるかは疑問です。例えば、特定のmicrofloraを持ったマウスの腸管での細胞を見れば、そのfloraトサイトカイン産生の因果関係は考察できるでしょうが、抗原刺激もわからずにどうこう言うのはどうなんでしょう。B6ならTH1寄り、Balb/cなら(biolegendのdatasheetの様に）TH2よりくらいは見れるかもしれませんが、それ以上は、、、、

(無題) 削除/引用 No.3007-9 - 2010/08/20 (金) 21:54:42 - Kazu 大切なのは、刺激の問題か染色の問題かを判別することなので、DCさんの仰るようにCD3/CD28で刺激すれば、IFN-γは検出されるはずです（ポジコン）。 これでちゃんと検出されたら、染色方法は概ねOKという判断の一助になると思います。

(無題) 削除/引用 No.3007-8 - 2010/08/20 (金) 13:58:58 - 黒齣 ＞DC様 コメントが付いていたことに気付かず、失礼いたしました。 ＞そもそも、Naive mouseのSpleenやThymocyteをご使用なのですか？ Naiveです。 また、特定のThサブセットに分極させるような刺激は行なっておりません。 ＞いきなりのPMA/Ionoの4時間刺激では対してCytokine産生見られないのでは？ そうなんですか？ たとえばこういった（↓）抗体を用いているんですが、 http://www.biolegend.com/pe-anti-mouse-il-4-antibody-893.html これを見る限り普通にPMA+Ionoで一回刺激をしているだけのように読みとれるのですが、間違っておりますでしょうか。 BDのLeukocActCocktailのプロトコルも一回だけの刺激だったように記憶しておりますが。 いずれにせよ、来週時間が確保できそうなので、固定の条件を変えて染色してみます。 コメントありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3007-7 - 2010/08/10 (火) 13:29:58 - DC そもそも、Naive mouseのSpleenやThymocyteをご使用なのですか？ 何かPrymary responseを誘導する処置をin vivoで行なっているのであれば問題ないと思いますが、もしNaiveマウス由来のT cellをご使用でなら、事前に一度anti-CD3/28やPMA/Iono等で叩いておかないと、いきなりのPMA/Ionoの4時間刺激では対してCytokine産生見られないのでは？

(無題) 削除/引用 No.3007-6 - 2010/08/10 (火) 09:53:01 - 黒齣 ＞UC様 再度ご回答ありがとうございます。 ＞BDの Cytofix/Cytopermのマニュアル それは見ておりませんでした。 途中からBioLegendのFoxp3 Perm/Fix bufferのプロトコルを採用しているのですが、操作停止可能なステップについての言及がなかったので、これまで表面抗原を測る際にしていたのと同様、固定液を添加した時点でストップしていました。 表面抗原はこれでも全く問題なかったのですが、細胞内サイトカインだと（というより抗体のエピトープの問題でしょうかね）注意しなくてはならないようですね。 その他の点もご指摘ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3007-5 - 2010/08/09 (月) 22:33:00 - UC 固定後、翌日まで保存ならamiさんの仰るように、「洗浄後」に保存すべきです。手元にあるBDのCytofix/Cytopermのマニュアル(もっとも僕は自作のもを好みますが)には、4%PFAで固定後、２回washして72時間までは4℃で保存できるよと、あります。 >やはり確認した方がよさそうでしょうか？ 問題点の絞り込みのために、自分なら迷わずCD69での活性化は確認します(予備実験で。サンプル数が多いのなら尚更です)。CD4のinternalizationとCD69との相関がどれほどかは知らないのですが、少なくともCD69で活性化が確認できていれば、ICSもうまく行くのを経験的に体験してます(ヒト)。この可能性が除外出来たら、抗体(IL-4, IFN-g)の品質ですかね。IFN-gなんかは、比較的容易に検出しやすい印象ですが。 余談ですが、ネガコンは、BFAのみを加えたサンプルだと思うのですが、こういうmixされたready-made試薬の場合、どうするんでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.3007-4 - 2010/08/09 (月) 20:04:14 - 黒齣 ＞UC様 ご回答ありがとうございます。 活性化試薬は、BDの「Leukocyte activation cocktail with BD GolgiPlug」を使っております。 http://www.bdbiosciences.com/external_files/pm/doc/tds/brm/live/web_enabled/23901Z_550583.pdf 到着後すぐに-80℃に保存しておいたもの（再凍結なし）を使用しておりますので、劣化しているとは考えにくいかと思います。 なお、CD69でのチェックはしておりませんでしたが、IL-17Aでの染色はわずかにうまくいっており、未刺激サンプルでは発現が全く認められないことと、活性化に伴うCD4のinternalizationが観察されていることから、活性化そのものはできているのではないかと考えておりました。 やはり確認した方がよさそうでしょうか？ ＞ami様 コメントありがとうございます。 検体数が非常に多いため、その日のうちには染色作業に取りかかることができず、どうしてもどこかのステップで冷蔵保存する必要があるのですが、固定液の状態で保存するよりも、固定・洗浄後のバッファー（FACS stain buffer）で保存した方がよさそうですね。 今度試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3007-3 - 2010/08/09 (月) 19:51:47 - ami > 固定、翌日まで冷蔵庫に放置し、洗浄 overnightで固定すると架橋がくっちゃくちゃになりすぎて染まらないと思います。翌日までもっていくなら、洗浄後に冷蔵庫すべきです。条件検討の段階では、規定の時間で染色まで進めるべきです。

(無題) 削除/引用 No.3007-2 - 2010/08/09 (月) 19:31:36 - UC 予備実験などで、十分に活性化が行われているなどのチェックはされていますでしょうか。BDのオンラインマニュアル（http://www.bdj.co.jp/pdf/64-039-01_p53-60.pdf）（ヒト全血での例ですが参考になると思います）には、PMAやBFAは再凍結不可とありますし、（予備実験において）CD69などの活性化マーカーでの確認は必須だと思います。経験上、CD69で全く活性が見られない場合、試薬がヘタっている可能性が高く（あるいは最終試薬濃度が適正値から外れている）、頑張って細胞内染色をしても見えるべきものは見えてきません。

Th1/Th2/Th17のFACS測定 削除/引用 No.3007-1 - 2010/08/09 (月) 17:37:58 - 黒齣 FACSで、マウス脾臓および胸腺細胞中のTh1、Th2およびTh17の割合を調べたいと思っています。 現在は、臓器から細胞を単離後、PMA+Iono+BFAで4時間刺激してから細胞を固定、翌日まで冷蔵庫に放置し、洗浄後、FITC-anti-CD4で染色してから、細胞を可溶化した後、抗IFNγ、IL-4およびIL-17A抗体で染色しているのですが、運がよいときにTh17が少し見える程度で、Th1とTh2はさっぱりです。 今はCD4陽性細胞のみを単離したり、各種Thサブセットへの分極条件下で培養したりといった作業はしていないのですが、（できれば）それらの作業なしに各種サブセットをFACSで測定したいと思っております。 どなたかご存じでしたらご教示ください。 よろしくお願いいたします。

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