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(無題) 削除/引用 No.3005-13 - 2010/08/11 (水) 23:56:19 - vitro中毒 さらにご回答ありがとうございます。 主にats様の方法を参考に48wellで試してみたところ、非常にうまくいきました。本当にありがとうございます。 よく回す方法もあるのは意外でしたが、選択肢の一つとしておきたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3005-12 - 2010/08/11 (水) 19:01:28 - sakura 私は24wellの場合播いた後激しく回し、細胞が中央に集まるようにします。 すると、集まった後自然に広がっていくので、均一に分散されます。 皆様とまったく逆ですが、もし上手くいかなかった場合、 試して見てください。

(無題) 削除/引用 No.3005-11 - 2010/08/10 (火) 02:23:57 - あかね 私の場合もatsさんの方法に近いです。 ベンチで細胞をWellにアプライしてから30分ほど放置して、細胞がそこに落ちるのを待ちます。 そしてゆっくりインキュベータにプレートを移動するようにしています。 私の細胞では問題なく均一にまくことができています。

(無題) 削除/引用 No.3005-10 - 2010/08/09 (月) 23:08:46 - vitro中毒 皆様ありがとうございます。 確かに細胞分布が不均一でも、再現性のある結果が得られれば良いのですが、扱っている細胞が細胞間接着にsensitiveなものなので、このトピックでお伺いした次第です。 U-bottomのプレートは使用経験がありませんが、縁近くの細胞密度が低くなったりしないのでしょうか？ 皆様のアイディア、非常に勉強になりました。基本的に、培地を多めに使い、plating後の振動を避ける点が重要のようですね。ぜひトライしてみようと思います！

(無題) 削除/引用 No.3005-9 - 2010/08/09 (月) 19:16:40 - UC 96-wellの場合、実験系によっては、U-bottom dishの使用を考慮しても良いかもしれません。細胞集団は自然にボトム中央に集まるので、そういう問題から開放されます。あと、24-wellで500uL/wellは少ない気がします。

(無題) 削除/引用 No.3005-8 - 2010/08/09 (月) 17:53:52 - かるち屋 横から失礼します。 私はむしろ毎回中央に寄せる感じで撒くことを意識しています。 撒いてから前後左右に激しく揺らすと、ほぼ毎回同程度に中央に寄ってくるので。 実験の種類によるのかもしれませんが、これで簡便に実験の再現性が得られる系であれば問題ないかと認識していましたが、どうなんでしょう？

(無題) 削除/引用 No.3005-7 - 2010/08/09 (月) 15:44:21 - TS 複合的な要因で起こることであり、それぞれ対応の仕方も違うと思うのですが、ウェルの縁側が高密度になってしまう１つの原因は、培地の表面張力のせいで、縁に近い方が培地の高さが高いからだと思います。 これは、入れる培地の量が少なければ少ないほど、大きく反映するものであって、少々もったいない気持ちもありますが、培地量を増やすことで、影響を小さくできるものだと思います。（相対的な差が小さくなる） わたしは、96、24-wellなら、培地0.2 mL, 2 mL入れます。 0.5mLだと、この影響はかなり受けるような気がします。 わたしは、できるだけ均一に細胞が懸濁されている溶液（細胞数を調整しておく）を試験管に準備し、上記の量をウェルに分注しています。試験管の中で細胞はすぐに沈み始めますから、プレート１列づつごとくらいに試験管（細胞懸濁液）を攪拌しています。それで、そぉっとCO2インキュベータに奥の方に入れ、誰にも触られないようにします。

(無題) 削除/引用 No.3005-6 - 2010/08/09 (月) 14:25:40 - ats 注ぐコツは特にないですが、跳ねない程度で素早く入れるくらいでしょうか。十分懸濁してあれば、ウェル壁からでも中央からでも差はないようです。とは言っても壁面と底面の角を狙うことが多いです。 なお、対流に関しては確証はないです。nnnさんが指摘していただいた振動の方が重要でしょう。 （nnnさん、勉強になりました。ありがとうございます。）

(無題) 削除/引用 No.3005-5 - 2010/08/09 (月) 13:46:21 - vitro中毒 早速のご回答ありがとうございます。 atsさま 　恥ずかしながら、対流まで気が回っておりませんでした・・・。でも、これは重要ですね。 　非常に接着が早い細胞なので、(2-1)でもいけそうな感じです。培地を注ぐ時の注意点などありますでしょうか。 nnnさま 　atsさまの方法は、振動の影響を可能な限り排除するのにも効果がありそうですね。せっかくそっとインキュベーターに置いても、他のメンバーに振動を立てられたら終わりですね・・・。フード内に置いておくのがやっぱりいいのかもしれません。過去topiも参考にさせていただきました。

(無題) 削除/引用 No.3005-4 - 2010/08/09 (月) 13:32:33 - nnn 振動（微振動）が主な原因でしょう。 （水の入ったコップを横から叩くと、同心円状の波面が見えますよね） 過去トピが参考になると思います。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;start=2;Code=2078 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;start=5;Code=1291 過去トピに追加で、 細胞がディッシュに接着する前に、 インキュベーターのドアを”バタン”と開閉しただけで、この現象は起こりえますので、 そーっと閉めるようにしましょう。

(無題) 削除/引用 No.3005-3 - 2010/08/09 (月) 13:25:55 - ats 他の良い方法もきっとあるとは思いますが私なりの方法を紹介します。参考になれば幸いです。 なお、できるだけ直前まで37℃に保温した培地を使用してください。 (1)細胞を通常の2倍量の温かい培地に懸濁し、ウェルに分注する。 通常量でも可能ですが、2倍量が失敗しにくいと思います。 (2-1)そのまま蓋をして（移動もしないで）、（水平な）クリーンベンチ内に30分ほど放置し、細胞を沈殿・接着させます。揺するとかえって不均一になるようです。 これができない場合は、(2-2)ディッシュを30-45度ほど手前側に優しく傾けて、そのままCO2インキュベーターに移動し、優しく水平に戻すように置きます。 ただし、金属棚に直接ではなく、きれいなコピー紙3枚やプラスチックトレイ等の上に置いてください。他のディッシュの上でも良いです。要は金属棚との距離を開けることです。ディッシュを傾ける理由は細胞が回らないようにするためで、もし細胞が筋状に寄ってしましったら、（回すのではなく）前後左右に数回45度ほど傾けて懸濁します。棚に直接置かない理由は対流を起きにくくするため（と思っている）です。 (3)翌日、通常量にするため培地交換を行ないます。細胞によっては死細胞を除く意味もあります。

蒔いたら 削除/引用 No.3005-2 - 2010/08/09 (月) 12:31:40 - ami 軽くプレートを遠心する。

小さなウェルに細胞を均等にまきたい 削除/引用 No.3005-1 - 2010/08/09 (月) 12:08:08 - vitro中毒 　よろしくお願いします。 　培養細胞をメインに実験をしているのですが、小さいウェル（24, 48, 96ウェルプレート）に細胞を均等にまくコツを知りたいと思いトピックを立てました。 　いつも細胞が中心とウェルの縁近くで高密度になってしまい、その間にドーナツ状の低密度領域ができてしまいます。 　24ウェルプレートなら500uL/wellの培地を使っています。培地を注いだ後縦横左右（円状ではない）に揺すったり、培地を勢い良く底に吹き付けるようにして揺すらずに静置したりしてみましたが、細胞の分布は自然と上記のように落ち着いてしまいます。 　どなたか良い方法をご存知でしたらご教授頂ければありがたいです。

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