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(無題) 削除/引用 No.2994-5 - 2010/08/14 (土) 18:46:38 - Boston >T7プロモーター下流にshort hairpin RNAをコードした二本鎖DNAを鋳型 これは、プラスミド上にある shRNA の３’末側を制限酵素で切断して、リニアーにしたものを鋳型に使用したということでしょうか？ひょっとして、antisense 21-mer 中にその制限酵素部位があったりしないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2994-4 - 2010/08/13 (金) 10:39:56 - in situ 最初ループ構造原因で泳動度が変わっているのかなと思いましたが、合成したものではそうならないようなので違うようですね。 T7ポリメラーゼ自体の性質に関しては詳しくないのですが、ループ構造のところを飛ばして転写が起きている可能性もありますね。 実験の目的が分からないのですが、人工合成でできているのであればそれを使うというのでは駄目なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2994-3 - 2010/08/13 (金) 00:41:08 - 初学者 ＞in situさま 遅レス申し訳ありません。 ホルムアミドで95℃、3分変性させた後に電気泳動しています。 また合成したコントロールも一本鎖です。 理由が分からず困っております。

(無題) 削除/引用 No.2994-2 - 2010/08/06 (金) 14:26:07 - in situ 以前同じような実験をしていました。 二つ質問です。 ・人工合成したものは一本鎖RNAですか？ ・TBE-Ureaゲルで泳動する直前に変性操作は行っていますか？（50％ホルムアミドを加えて65℃10分→on iceとか）

Ｉvitro transcriptionde短いバンドが出る？ 削除/引用 No.2994-1 - 2010/08/05 (木) 21:25:51 - 初学者 最近In vitro transcription(IVT)を開始した者です。 目的鎖長のRNAが作製できず、困っております。 私は、T7プロモーター下流にshort hairpin RNAをコードした二本鎖DNAを鋳型としてIVTを行っています。本来ならば49merのRNAが作製できるはずなのですが、IVT産物をTBE-Ureaゲルで電気泳動すると、49merより下（40-45mer程度?)のあたりにバンドが出現します（同一の49merの配列を化学合成し、並行して泳動しております）。 このような場合、何が原因と考えられるのでしょうか。 ちなみに、用いているキットはTAKARA製の普通のT7ポリメラーゼです。 また配列は下記の通りにデザインしており、loopは汎用性の高いもの（Brummelkamp et al, 2002, Science)を使用しています。 (T7;20mer)-(sense;19mer)-(loop;9mer)-(antisense;21mer) TAATACGACTCACTATAGGG-19mer-TTCAAGAGA-21mer 配列が明記できず申し訳ありませんが、ご回答いただければ幸いです。 よろしくお願いいたします。

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