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(無題) 削除/引用 No.2990-8 - 2010/08/06 (金) 19:09:10 - RT-PCR やはりそうですよね。 試薬類を一新してコンタミの可能性を排除し、DNaseもいろいろ試してみたいと思います。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2990-7 - 2010/08/06 (金) 11:06:11 - Pumpkin みなさんの[gDNAのコンタミ]に一票 >ExTaqに逆転写活性があるという可能性よりも、DNAのコンタミを拾っている可能性のほうがはるかに高い

(無題) 削除/引用 No.2990-6 - 2010/08/06 (金) 07:12:26 - 通りすがり 他の方もおっしゃっていますが、おそらくイントロンを挟まないプライマー設計になっているのでしょう。 　私の推測では、起こっていることは、「ExTaqが混入したゲノムDNA（あるいはｃDNA)を鋳型に走ってしまっている」のだと思います。 　まず、DNase処理ですが、したほうがいいのは確かですが、なにぶんPCRが非常に感度の高い方法ですので、わずかに残ったDNAを検出してしまう可能性は十分にあります。 　あと、他社のTaqではバンドは出ないとのことですが、私はこれと深く関係のある経験をしたことがあります。マウスのGenotypingに、以前はX社のTaqを使っていたのですが、バンドが出たり出なかったりするので、TaKaRaのExTaqに変えたところ、くっきりとバンドが出るようになりました。TaKaRaのExTaqの性能が、比較対照のTaqよりも高いという可能性は十分にあると思います。（宣伝じゃないですよ) 　なので、やはり、ExTaqに逆転写活性があるという可能性よりも、DNAのコンタミを拾っている可能性のほうがはるかに高いように思います。

(無題) 削除/引用 No.2990-4 - 2010/08/05 (木) 14:54:28 - その前に ＞Ex Taqを用いてRNAを鋳型にした増幅（Ex Taqの逆転写活性）を体験された方いらっしゃったら教えてください。 こんな活性が、もしも無視できないくらいにあるとしたら、それはこの酵素が RT-PCRには使えないということになるのではないですか？ これだけ良く使われている酵素ですよ・・・。

(無題) 削除/引用 No.2990-3 - 2010/08/05 (木) 11:23:10 - g-aj RT-PCRのプライマーはイントロンを挟んで設計してありますか？ ExTaqの逆転写活性よりも 不完全なDNase処理、あるいは試薬、ピペットのコンタミを 疑うべき状況だと思います。

(無題) 削除/引用 No.2990-2 - 2010/08/05 (木) 11:23:03 - zzz 使ったExTaq、buffer、dNTPなど、既にDNAがコンタミしていた可能性は？ >（ABIのSybr Green assay）RTの有無で明確に差があります。 これは、RT（-）のサンプルでは検出感度以下という結果でしょうか？

Taq polymeraseの逆転写活性 削除/引用 No.2990-1 - 2010/08/05 (木) 11:00:08 - RT-PCR Takara Ex Taqを使ってRT-PCRをしましたが、逆転写処理をしないサンプルでもPCR産物が検出されました。ちなみに逆転写前にはDNase処理をしており、また他の酵素でPCRをすると（ABIのSybr Green assay）RTの有無で明確に差があります。まだいろいろなコントロール実験は必要かとは思いますが、Ex Taqを用いてRNAを鋳型にした増幅（Ex Taqの逆転写活性）を体験された方いらっしゃったら教えてください。

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