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ありがとうございます 削除/引用 No.2985-3 - 2010/08/05 (木) 13:50:03 - to Aさま ありがとうございます。 さっそく参考にさせて頂きます。

誘導時にZnCl2添加 削除/引用 No.2985-2 - 2010/08/04 (水) 17:43:16 - A > その際に発現・精製について有用な方法等がありましたら、 > 教えて頂きたいと思い投稿しました。 > 具体的な方法だけではなく、 > 大腸菌内の亜鉛濃度や取り込みについて、 > 金属タンパク質の金属保持能力(buffer交換等に対して) > などについての助言等もありましたらお願いします。 あまり詳しく言うと身元がばれるのでリファレンスは示せませんが 以前Zinc fingerを大腸菌で発現-精製していた同僚の論文を 確認してみました。 <発現> 大腸菌：BL21(DE3)pLys 誘導時のOD600:0.6 誘導:1mMIPTG(final) 添加:10uM ZnCl2(final,誘導時に添加) 発現誘導時の温度:37°C(？はっきりしませんが多分この温度) <精製> 1.SP-sepharose 2.Mono-S 3.Gel filtration の順でカラム精製 この方法がそのままトピ主さんのケースにあてはまるとは 必ずしも思えませんが、誘導時に10uM ZnCl2を添加するのは 参考になると思います。同僚が発現時にZnCl2を添加するのを 忘れて蛋白質が全て沈殿に行ってしまったのを見たことが ありますから。

RINGドメイン(Zinc finger)を持つタンパク質の精製方法 削除/引用 No.2985-1 - 2010/08/04 (水) 14:28:28 - to 金属タンパク質の精製についてご教授願います。 現在、大腸菌にて発現したRINGドメインを有する タンパク質の精製を試みていますが、 超音波破砕後に遠心操作を行うと不溶化してしまい 精製できていない状況です。 また、RING遺伝子の近傍に位置する未知遺伝子とともに発現を行うと 同様に遠心した場合でも上記のRINGタンパク質が可溶性を示すように なり精製できるかと期待したのですが、 その後クロマトグラフィ(陰イオン交換、疎水カラム等)を行うと 未知タンパクはピークとして検出できるのですが、 RINGタンパク質は同じピーク内に微量にのみ存在し 他のピークとしては観察されません。 (カラムに吸着した未知タンパク質と相互作用している RINGタンパク質が徐々にはがれてしまっているのではと考えています) クロマトグラフィ等の精製方法についても検討してみますが、 精製時に亜鉛を加えることで、RINGタンパクが正しくfoldingし、 可溶化もしくは未知タンパク質との強い相互作用が起こるのではと 期待しています。 その際に発現・精製について有用な方法等がありましたら、 教えて頂きたいと思い投稿しました。 具体的な方法だけではなく、 大腸菌内の亜鉛濃度や取り込みについて、 金属タンパク質の金属保持能力(buffer交換等に対して) などについての助言等もありましたらお願いします。 簡単なスペックとしましては 両タンパク質は10 kDa弱で、 大腸菌はBL21 CodonPlus (DE3)を使いIPTGにより誘導発現 Sonicationによる超音波破砕 カラムにはHiTrapQ、Resource ISO or PHEなどを 用いています。

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