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(無題) 削除/引用 No.2966-22 - 2010/08/04 (水) 18:55:25 - ATG みなさま、多くのアドバイス本当にありがとうございました。 昨日、他の人に見てもらいながら作ったゲルを本日使ってみたのですが、見事気泡が入ることなく使えました。成功へのポイントは、コームの材質と濃縮ゲルを載せすぎないこと、あと重層した水を除いたら、素早く濃縮ゲルを注ぐってことが大事だったような気がします。 いつもはコームを抜くのに、濃縮ゲルにくっついて苦労していましたが、今日はすっと簡単に抜けました。また自分1人で作ってみようと思います。 このトピックにレスして下さったみなさん、本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2966-20 - 2010/08/04 (水) 06:30:50 - BCG ゲルとコームがくっ付きやすくてはずすときにゲルが引っ張られるようならば、テフロン製のコームにするとある程度改善すると思います。 あとゲルが固まったあとも長い時間コームをさしっぱなしにしてるとくっ付きやすくなるきがします。

(無題) 削除/引用 No.2966-19 - 2010/08/03 (火) 20:29:38 - ATG みなさん、本当にアドバイスありがとうございます。 今日、他の人に見ててもらいながら作りました。そのゲルはまだ使用していないので上手く言ったかどうかは分かりませんが・・・ >[Re:17] ===さんは書きました : >[Re:15] ===さんは書きました : >[Re:14] stuさんは書きました : 確かに、他の人とはコームの材質が違っていました。また、濃縮ゲルの量も私と比べると大分少なく、あまり載せすぎないようにしていました。 >[Re:13] toyoさんは書きました : > うちでは泳動バッファーを注いでから最後にコームを抜いています。 > 泳動バッファーを注がずにコームを抜いた経験はありません。 今度からはそうしてみます。しかし、色々なプロトコールを見ていると、先にコームを抜くところとバッファーを注いでから抜くところがあるみたいです。http://www.pssj.jp/archives/Protocol/Measurement/PAGE_01/PAGE_01_02.html では先に抜いてから泳動槽にセットしています。 あと、分離ゲルを固まらせたあと、重層した水を除いてから濃縮ゲルを入れるまでの時間も短くしていました。 以上が他の人と私のゲル作製での違いでした。 しかし、何回かコームを抜く前に気泡が入ったことがあります。 この場合は重層した水を除いた後、濃縮ゲルを入れるのに時間がかかりすぎて、分離ゲルが乾燥してしまったと考えてよろしいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2966-17 - 2010/08/03 (火) 17:28:52 - === コームの材質について、もう指摘されていましたね。 個人の好みですが、私は濃縮ゲルを山盛りに盛って固め、あとから余分を切り落としています。切り落とすのは、切り欠きのあるガラス板の斜めの面とコームの間にできる楔型の隙間に溜まった部分です。イメージとしては、プラモデルの部品とランナーを切り離すかんじです。余計分かりにくいでしょうか。この方法だとウェルとウェルの間のゲルの高さがかならず揃い、ウェル容量いっぱいに試料をアプライできるので私は好んでそうしています。でも、ランナーを切らないと、中年さまの仰る理由でコームが抜けないかゲルが壊れます。ランナー切りをするならバッファーの中で作業するのがスムーズに思います。コームの実質部位が空気と入れ替わる、またはバッファーと入れ替わる過程が穏やかに進むのが理想ですね。

(無題) 削除/引用 No.2966-16 - 2010/08/03 (火) 17:03:14 - 中年 私は、aimar様と同じく、またトピ主様が > コームを抜くとき、濃縮ゲルがコームに引っ張られてしまうことで空気が入るみたいなのですが、濃縮ゲルの量が多過ぎるということも原因として考えられるでしょうか？ とお書きになっているように、スタッキングゲルが多すぎて、コームを抜くときにコームとゲルとの隙間から空気が入って行く経路を塞いでしまって、ウェル内が陰圧になってしまっていることが原因だと思います。ちょっとコツが要りますがコームを抜くときに空気が入っていくこと確認しながら抜くようにすると良いでしょう。同じ目的のために、コームを抜く前に、固まり損なったアクリルアミド溶液をペーパータオル等で十分に除くことが有効かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2966-15 - 2010/08/03 (火) 16:23:02 - === コームとゲルの離れが良くないのですね。無理にコームを引っ張るとゲル内に陰圧がかかり、弱い場所から壊れてしまいます。 >ゲル板とコームを自分専用で使っていたのですが、これが原因ってことは考えられますか？ 考えられると思います。巧くできている人のコームを借りてみてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2966-14 - 2010/08/03 (火) 15:49:36 - stu コームの材質によってはゲルにベタベタくっつく材質がありますけど、 そのコームは他の人も使用しているコームでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2966-13 - 2010/08/03 (火) 11:54:16 - toyo >コームを外してから泳動槽にセットし、泳動バッファーを注いでいたのですが、 >これは泳動バッファーを注いでから最後にコームを抜くということでしょうか？ ここに一票。 うちでは泳動バッファーを注いでから最後にコームを抜いています。 泳動バッファーを注がずにコームを抜いた経験はありません。 うまくいっている人の手技を隣で見せてもらうのが一番よいとは思いますが。

(無題) 削除/引用 No.2966-12 - 2010/08/03 (火) 11:42:02 - ATG コームを抜くとき、濃縮ゲルがコームに引っ張られてしまうことで空気が入るみたいなのですが、濃縮ゲルの量が多過ぎるということも原因として考えられるでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2966-11 - 2010/08/03 (火) 11:15:12 - ATG >[Re:10] んさんは書きました : 間違えてすみません。乾かすではなくてゲルを固めるの間違いです。 >[Re:9] bさんは書きました : 私はせいぜい15分しかやってません 他の人は1時間固めても問題なかったと言っていました。しかし、次は15分程固めたら濃縮ゲルを入れようと思います。 >[Re:8] BCGさんは書きました : > > 水を重層してゲルが固まった後そのままいつまでも置いておいたゲルを使うとそういう事あるね。ゲル液で軽く共洗いしてそれでそれをしっかり捨ててから濃縮ゲル液入れるとたぶん大丈夫と思う。前日とかに作ったゲルを使うときはそうしてる。 濃縮ゲルで2回ほどリンスしてみたのですが、症状は改善されませんでした。 ゲル板とコームを自分専用で使っていたのですが、これが原因ってことは考えられますか？次ゲルを作製する時は、ゲルを作るのを隣で見てらうと同時にゲル板も他の人が使っているのを借りようと思っています。

(無題) 削除/引用 No.2966-10 - 2010/08/03 (火) 09:05:38 - ん ＞MilliQ水を重層して1時間ほど乾かす すいません。日本語の意味がわかりません。 この作業はゲルが乾燥したり、空気中の酸素に触れると重合に悪影響がでるための理由だったと思います。 ちなみに私は超純水を飽和させたブタノールを使っています。

(無題) 削除/引用 No.2966-9 - 2010/08/02 (月) 23:09:18 - b >MilliQ水を重層して1時間ほど乾かす これが長すぎませんか？私はせいぜい15分しかやってません

(無題) 削除/引用 No.2966-8 - 2010/08/02 (月) 21:34:02 - BCG 水を重層してゲルが固まった後そのままいつまでも置いておいたゲルを使うとそういう事あるね。固まったら早めに濃縮ゲル作った方がいいかも。でも空気入ってて大きなものでない限り普通に流れて、泳動が乱れたりしなかったです。他の人が言ってるようにゲル液で軽く共洗いしてそれでそれをしっかり捨ててから濃縮ゲル液入れるとたぶん大丈夫と思う。前日とかに作ったゲルを使うときはそうしてる。 あとmillQ水重層して乾かす、というのは何を乾かすのですか。

(無題) 削除/引用 No.2966-7 - 2010/08/02 (月) 18:04:21 - aimar コームをとにかくゆっくり抜く。 あるいは、濃縮ゲルを載せすぎない。 過剰量載せてしまったら、ピペットマンで吸い取る。 では、どうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2966-6 - 2010/08/02 (月) 17:41:52 - ATG >[Re:5] ===さんは書きました : 濃縮ゲルを少量載せてリンスし、捨てます。あらためて濃縮ゲルを注いで重合させます。 リンスですか。やってみます。 > 泳動バッファがゲルを覆うようにセットします。 > 注射針を使い、ゲルとコームを切り離します。 > コームを引き抜きます。 > ゲルが引っ張られるなら、注射針で再度切り離してからコームを抜いてください。 コームを外してから泳動槽にセットし、泳動バッファーを注いでいたのですが、これは泳動バッファーを注いでから最後にコームを抜くということでしょうか？ >[Re:4] NFさんは書きました : > では一度実際に作ってもらい、それを観察してみてはいかがでしょうか確かにおっしゃる通りです。そうしたいのですが、最近私の周りで泳動している人がいないので、横で見てもらいながら自分で作ってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.2966-5 - 2010/08/02 (月) 16:03:41 - === >濃縮ゲルと分離ゲルの間に気泡 濃縮ゲル溶液を多めに作ります。 分離ゲルに重層したmilliQ水を除いた後、濃縮ゲルを少量載せてリンスし、捨てます。あらためて濃縮ゲルを注いで重合させます。 >泳動する直前にコームを抜くのですが、その時に気泡が入ってしまいます。 >コームにゲルが少し引っ張られる 泳動バッファがゲルを覆うようにセットします。 注射針を使い、ゲルとコームを切り離します。 コームを引き抜きます。 ゲルが引っ張られるなら、注射針で再度切り離してからコームを抜いてください。

(無題) 削除/引用 No.2966-4 - 2010/08/02 (月) 15:06:55 - NF では一度実際に作ってもらい、それを観察してみてはいかがでしょうか（横で同じように自分で作ってみてもいいかもしれません）？

(無題) 削除/引用 No.2966-3 - 2010/08/02 (月) 14:25:01 - ATG >[Re:2] NFさんは書きました : > 他の人がうまくいっているのでしたら、うまくいっている人の試薬を使わせてもらい、うまくいっている人からアドバイスをもらってはいかがでしょうか？同じ研究室で同じ装置を使っているのでしょうから、ここで質問するよりも、それの方が早いですし、そうするべきだと思います。 上手くいっている人と試薬や組成は同じです。なので操作に問題があると思いました。他の人に聞いてみたのですが、同じようなやり方で作っているといわれました。

(無題) 削除/引用 No.2966-2 - 2010/08/02 (月) 14:13:18 - NF 他の人がうまくいっているのでしたら、うまくいっている人の試薬を使わせてもらい、うまくいっている人からアドバイスをもらってはいかがでしょうか？同じ研究室で同じ装置を使っているのでしょうから、ここで質問するよりも、それの方が早いですし、そうするべきだと思います。

SDS-PAGEのゲルに入る気泡 削除/引用 No.2966-1 - 2010/08/02 (月) 13:18:45 - ATG こんにちは。早速質問です。 SDS-PAGE用のゲルを作っているのですが、濃縮ゲルと分離ゲルの間に気泡がよく入ってしまいます。（3回に2回は入ってしまう） 泳動する直前にコームを抜くのですが、その時に気泡が入ってしまいます。コームを抜くとき、濃縮ゲルが軟らかいのか、コームにゲルが少し引っ張られるので気泡が入るのではないかと考えました。下に私の作り方を載せましたが、なにか改善点やアドバイスがございましたらよろしくお願いします。 ちなみに研究室のほかのメンバーはこの症状がなく、私だけの症状のようです。 ゲルの組成 分離ゲル(10％) 30%アクリルアミド/0.8%ビスアクリルアミド2.25ml 緩衝液　1MTris-HCl　pH8.8/0.27%SDS　3.15ml Milli Q 2.5ml 10%APS 60ul TEMED 10ul 濃縮ゲル 30%アクリルアミド/0.8%ビスアクリルアミド0.5ml 緩衝液　0.25mM Tris-HCl pH6.8/0.2%SDS　1.5ml Milli Q 1ml 10%APS 15ul TEMED 10ul です。 ガラス板を２−プロパノールで拭き、乾いたらゴムをセットして、スペーサーの上、クリップで挟み、分離ゲルを入れたら、MilliQ水を重層して1時間ほど乾かす。そして、注射針を使って重層したMilliQ水を捨て、分離ゲルを入れ、コームをさして、30分程放置して乾かす。クリップとゴムを外してラップに湿らせたキムワイプをのせて4度でゲルを保存しています。

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