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頑張ってください 削除/引用 No.2964-7 - 2010/08/23 (月) 22:41:48 - 悪地蔵 反応液量が解りませんので、自分の場合で書かせていただきますと 25μlでの反応中にhunam genome DNAを10ng加えれば、ミスマッチプライマー でないかぎり大抵の場合増幅しております。 Template, Primerともに入れすぎは良くありませんので、 プライマー濃度も変化させてみるのが良いかと思います。 自分の場合ですと Template :上記の量 Primer：それぞれ最終濃度300nM MgCl2:1.5mM を基本条件として、それから良い条件を探して行きます。 （アニーリング温度は2℃単位で振っています） また、マルチバンドとのことですので、数%程度のDMSOの添加を同時に検討されると良いと思います。 色々試した結果、プライマーの再設計が正解と言うこともままありますので、 ある程度試して改善しないようならボスに相談してみたほうが良いと思います。 経験者さんの書かれているように、step down PCRも良い手だと思います。 どちらかというと、もう少し長いPCRで良くお世話になっている方法です。

(無題) 削除/引用 No.2964-6 - 2010/08/04 (水) 19:30:05 - 経験者 用いる酵素の適正にもよると思いますが、KOD-Plus-Neo（アニーリングを行わない2ステップサイクルを基本としている）では、ステップダウン法（伸長温度を5サイクルずつ、74、72、70、68度の順で行い、最後に68度で15-30サイクル行う）がかなり効果的でした。通常の2、3ステップの場合でスメアになったのが、ステップダウンに切り替えたらバッチリ。以後、面倒なので常にステップダウン法で行っています。

(無題) 削除/引用 No.2964-5 - 2010/08/01 (日) 16:38:19 - サム ＞ぶんさん ・ＤＮＡ濃度はtotalで50ngとしています。 10ngでもバンドは出ましたが、ボスの意向により50ngを選択することになりました…。 キットを使用しており、その保証する最低ＤＮＡ濃度が10ngなのでそれ以下は検討していません。 濃度を薄くすることでノンスペのバンドは薄くなりましたが、、それはただ濃度が薄くなったからだと考えておりました。 ・サイクル数は３５サイクルです。 目的とするバンドの方が濃いです。 本を読み直して検討してみます。

目的のバンドを 削除/引用 No.2964-4 - 2010/08/01 (日) 10:49:02 - ami 目的のバンドをピペットチップでつんつんつつき、PCR反応液の中に突っ込んで洗ってPCR･･･必ずシングルバンドにはなりますが･･･

(無題) 削除/引用 No.2964-3 - 2010/08/01 (日) 08:37:15 - ぶん >ＤＮＡの濃度を検討し、50ng/ulで行うことにしました。 >Primer濃度の検討をし、10uMを1ul使用しています。 PCR反応液中の終濃度が50ng/ulなんですか？ 前はもっと濃くやってたのですか？ それ以下の濃度ではバンドが出ないのでしょうか？ 検討結果が書かれていませんがDNA濃度・Primer濃度の検討で少しはノンスペが減ったのでしょうか？ もうちょっとPCR条件（ボリュームやサイクルなど）を書いた方が良いと思います。 一番簡単なのはアニーリング温度を上げる事 そのプライマーのTmがわかりませんが、とりあえず 2-3℃ずつぐらいで上に振ってみれば良いと思います。 伸長時間を短くする事（目的より大きいサイズノンスペが出てるから） プライマーを見直す もっと特異性のある場所に変えられるのなら変える サイクル数を検討する 今は何サイクルですか？ノンスペと目的バンドはどっちが濃いですか？ が簡単にできると思います。後はPEGを入れたり色々ありますが、とりあえず 上記の事を試してみればいかがでしょうか？ ラボにPCRの本はありませんか？なければ立ち読みでも良いので（買った方が良いですけど。図書館とかでも） 読んでみると良いと思います。

PCRでのノンスペを無くしたい 削除/引用 No.2964-1 - 2010/08/01 (日) 03:46:19 - サム お世話になります。 現在ヒトゲノムを用いてＰＣＲを行っています。 目的productsの大きさは270-310bpくらいです。 しかし、500、400、350bpあたりにいくつかのノンスペのバンドがあります。 ボスからこのノンスペをなくすように言われました。 まずＤＮＡの濃度を検討し、50ng/ulで行うことにしました。 次にPrimer濃度の検討をし、10uMを1ul使用しています。 アニーリングの温度は５６℃です。 どうしてもノンスペが無くならないのですが、次に必要な検討としては何が考えられますでしょうか。 アニーリングの温度を上げたら良いのでしょうか？ それは１℃ずつなどでよいのでしょうか？ ＰＣＲの検討（けいの立ち上げ方）の方法を教えていただけませんでしょうか。 よろしくお願いします。

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