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(無題) 削除/引用 No.296-11 - 2009/04/11 (土) 10:46:10 - yt 培養細胞ならもう少し方法があるかも知れませんが、組織からだと手段は限られる気がします。 もしマウスとかからの新鮮な組織ならトリプシン処理して細胞をばらして、primary cultureの状態にしてからという方法もあるかも知れませんが、ﾋﾄからとかだと大抵は急速凍結するでしょうから、そういう場合には全部まとめてlysateかhomogenateにするしかないでしょうね。 homogenizeしても膜とのassociationが保たれてれば、膜分画を取ってくる方法もありかも知れません。 　 いずれにしても、表在性だとすれば　おお　さんもご指摘のようにTriton X-114はあまり有用ではない可能性が高いと思います。

(無題) 削除/引用 No.296-10 - 2009/04/10 (金) 10:55:11 - 初心者 皆様ありがとうございました。とても参考になりました。 初めてですので、とにかく色々な方法で試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.296-9 - 2009/04/09 (木) 14:48:40 - おお 膜表ざい性で膜に埋もれる部分や、アンカーなどがなければ Triton X-114はちょっと無理があるかもしれません。 Triton X-100 (1%くらい)で膜を可溶化するくらいでいいかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.296-8 - 2009/04/09 (木) 01:36:30 - 初心者 すみません、書き忘れました。みたいものは、表在性膜タンパクです。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.296-7 - 2009/04/09 (木) 01:34:03 - 初心者 有り難うございました。私がみようとしているのは細胞表面タンパクです。 Triron X-114の論文、プロトコール（できれば英語）を探しているのですが、組織からの抽出で、これというものがみつかりません。もしよろしかったら教えていただけると助かります。よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.296-6 - 2009/04/08 (水) 14:36:44 - yt 「細胞表面タンパク」と言うのは「表在性膜タンパク」のことですか？ 内在性膜タンパクやGPI繋留タンパクも含めた膜タンパク全般のことでしょうか？ もし表在性膜タンパクのことだとしたら、どのように膜表面に固定されてるかで抽出法は違ってくるような気がします。 　 ちなみにTriron X-114による抽出は自分は日常的に行いますが、一番適してるのはGPI繋留タンパクなどの強い疎水性部分を持つものです。これらのタンパクがdetergent phaseに抽出されて、可溶性の細胞質タンパクなどは水相に抽出されるので、detergent phaseにくるのであれば非常に有用ではありますが、もしその目的のタンパクが疎水性が強くないのであれば有効ではない可能性もあります。

(無題) 削除/引用 No.296-5 - 2009/04/08 (水) 09:15:53 - 初心者 細胞表面タンパク質をビオチン化。なるほど、初めて知りました。 ありがとうございます。おっしゃる通り、組織からですとやはり何かに溶かして抽出後になりますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.296-4 - 2009/04/08 (水) 08:49:20 - ひろ 細胞表面タンパク質をビオチン化して、その後ビオチン化タンパク質をストレプトアビジンビーズなどで回収する方法もあります。 でも、組織だと使えないですかね...

(無題) 削除/引用 No.296-3 - 2009/04/08 (水) 05:35:27 - 初心者 早速ありがとうございました。TRITONXー114で検索すると結構でてきました。尿素と両方やってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.296-2 - 2009/04/07 (火) 22:29:22 - おお 有効かもしれませんね。尿素を使うと細胞の殆どのタンパクがか溶化されると おもいます。ただし、コラーゲンとか中間けいフィラメントなどかか溶化 しにくいタンパク質もありますが、、、 尿素はその分解物がリジンを修飾しますので場合によっては抗原性が 下がるかもしれません。私はよく使いますが概ね良好ですが、 避ける人もいます。 組織でしたら、RIPAバッファーを使う人は結構いるとおもいます。 サンプルバッファーで直接というのもてかもしれません。 ただし、これらのバッファーはどちらかというと可也タンパク抽出 能力が高いです。感度やバックを下げるためにもっとマイルドな 抽出方法を選ぶ人もいるかと思います。 膜表面と言う事なのでちょっと違うかもしれませんが、膜に埋もれている タンパクであればTRITONXー114で低温で溶解し30度くらい(だったかな) で遠心するとTRITON Xー114がまく成分を取り込んで水層と分離するので 膜タンパクを濃縮できます。 ピアスMEN-Pだったかな、、、、たぶん同じような方法を取るのだと思いますが まくたんぱく質を溶解できるものが売っています。 あとは文献も探ってみてください。

細胞膜表面タンパクの分離 削除/引用 No.296-1 - 2009/04/07 (火) 21:52:23 - 初心者 いくつかの組織から細胞表面のタンパクを分離して、ウェスタンで発現をみようとしていますが、方法はどのようなものがあるのでしょうか？尿素を使う方法は有効でしょうか？初めてで全くわかりません。教えていただけますと助かります。どうぞよろしくお願い致します。

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