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(無題) 削除/引用 No.2949-7 - 2010/08/13 (金) 17:49:36 - バキュロ初心者 異伝子 様 ご返信ありがとうございます。 アドバイス、非常に参考になっております。 回収するのは、80%のSF-9細胞が剥離するのを目安にしています。（感染後6日、遅いのかもしれません） ウィルスの増幅は、6ウェルプレートに 2x 106のSf-9を播種し、1時間後に感染させています。 ご指摘にありました通り、この時点ですでにコンフルエントです… これがいけないのでしょうか？ 現在接着系にて培養していますが、一つ気になることがあります。 継代の際にトリパンブルーで染色すると1/4 くらいは染まっています。（継代は、細胞に直接メディウムを吹きかけ、剥離させ、その後遠心し、再懸濁したものをトリパンブルーで染色）。 この点も何か関係しているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2949-5 - 2010/08/13 (金) 15:51:56 - 異伝子 BacPAK qPCR Titration Kitは使ったことないので知りません。この測定値が正しいとしたら Sf9細胞の初期濃度が高すぎるのでは？細胞がコンフルになってしまうとウイルスは増えません。 InvitrogenのBac to Bacのuser manualも見たことがないのでどう書いているか知りませんが、自分の細胞のコンディションに合わせた初期濃度にするのがよいでしょう。1週間くらいでコンフルになるように細胞を撒いて、翌日にでもウイルスを感染させてみてください。 ウイルスタイターが低かったときは、ウイルス回収時にちゃんと細胞が浮いていましたか？

(無題) 削除/引用 No.2949-4 - 2010/08/12 (木) 17:34:12 - バキュロ初心者 いつも拝見させていただいております。 その節はお世話になりました。 昆虫細胞にバクミドをトランスフェクトした後に、ウィルス液（P1）を無事得ることが出来ました。 しかしながら、タイターは10の5乗オーダでした。また、このP1液をMOI=0.1にて、感染させウィルス液（P2）のタイターを計ってみると2、3倍くらいしかあがっておらず、目標の10の9乗オーダには程遠いものです。 （ちなみにタイターは測定はBacPAK qPCR Titration Kitを使用しています） これは何か、試験系に問題があるのでしょうか？P3で、10の9乗まで上げるとすると、やはり最初のP1の取得がキーになるのでしょうか？ アドバイス等いただけると非常に参考になります。ご指導のほどよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.2949-3 - 2010/07/28 (水) 23:26:47 - バキュロ初心者 mAb 様 貴重な情報ありがとうございます。 先程早速、そのことを念頭に試験を開始いたしました。 今度は上手く確認できることを願っております。

(無題) 削除/引用 No.2949-2 - 2010/07/28 (水) 17:25:23 - mAb ウイルス作出の目安は付着しているsf9細胞の浮遊（剥離）です。 通常、5日程度で細胞が明らかに浮き出すので、3日目では少々早いかもしれません。 なお、トランスフェクト時にネガコンとしてバクミドを入れないコントロールを設けると比較が容易です。 ちなみに１週間放置しても全く細胞が浮かない場合は、トランスフェクションorコンストラクションに問題があるかもしれません。

バクミドのトランスフェクト（SF-9） 削除/引用 No.2949-1 - 2010/07/28 (水) 12:04:59 - バキュロ初心者 いつもこちらを拝見させていただいております。 現在、SF-9にバキュロウィルスを感染させ、組み換えタンパクを精製する試験を行っております。（InvitrogenのBac to Bacを使用しています） 組み換えバクミドをPCRにてインサートを確認し、SF-9にトランスフェクトを行っています。 72時間後にSF-9を観察しても、感染の徴候（細胞が大きくなったり、増殖がとまったり）が全く見られません。 条件は、InvitrogenのBac to Bacのuser manualを参照にています。 このP1液取得時の昆虫細胞の形態変化は、どの程度見られるものなのですか？ 初心者のため、全く分からず困っています。どなたかにご教授いただけると幸いです。

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