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(無題) 削除/引用 No.2944-22 - 2010/08/16 (月) 20:48:11 - ami 逃げてー！　早く逃げてー！

頑張って 削除/引用 No.2944-21 - 2010/08/16 (月) 16:55:23 - 技術補佐員 皆さん研究者目線でご回答されていますが、研究者は時間に囚われず奔放ですが、 技術補佐員は勤務時間が決まっているのでアドバイスに答えている時間はなかなか持てないと思います。 結果さえ出せれば税金の無駄ではありませんし、日夜頑張っている研究者の方でも結果が出せなければ税金の無駄遣いです。 結果が出せるように頑張ってください。 本題ですが、私の場合はイヤーパンチを洗浄しなくても結果が出ます。 PCRでは、必ず水のみのチューブを1つ作っています。 これは常識ですが、素人は知らなくて当然。 今日から実行してください。 かなり個性的な教授なので、たった1つの余分なチューブも無駄だと言い出しかねませんね。 その時にきちんと説明できるように実力を付けてください。 教授を論破して正道を歩めるくらい力をつけるしかない！ あなたは、研究者ではないのですから「わらなくて当然」です。 知らない事を馬鹿にする人達は無視して頑張ってね。

(無題) 削除/引用 No.2944-20 - 2010/08/16 (月) 16:10:01 - fish 皆言ってますよね。何故みんなのアドバイスに一つずつ答えないのですか? 常識や倫理の問題と思いますよ。 水だけのネガコンは? 後は何も答えなくてよいので、 この質問だけに答えてください。 マウスのゲノムを加えていない、酵素とバッファーと水だけで PCRのバンドは確認できますか？ ３匹ネズミがいたとします。３匹からゲノムを回収します。 PCRをかけるのは、この3匹と、 何のゲノムも加えていない水とで合計４つPCRをかけてますか？ あまりにひどいというか、税金の無駄遣いに感じます。 あと個人で買えという教授ならば、すぐ辞めた方がいいです。 貴方が頑張ってるのは十分分かりますが、あまりにいい加減すぎます。 関係ないのにすみません。 後はご自身でお考え下さい。

(無題) 削除/引用 No.2944-19 - 2010/08/16 (月) 15:23:04 - 小言幸兵衛 逃げてー！　早く逃げてー！

(無題) 削除/引用 No.2944-18 - 2010/08/16 (月) 15:13:54 - あんこ >あなたがチェックしている遺伝子を導入していないマウスを買えば良いのです。 欲しければ自分で買え。研究室には予算が無いと言われました。 マウスを個人で購入することは可能なのでしょうか？ 皆様は個人で購入する場合はどこで購入されていますか？ PCRの試薬を全て新しくして行っても(2回目の実験)バンドが出たので、それを信じることにしました。 全て新しくする前の試薬も使ってPCRしましたが、当然これもバンドが出ました。 試薬の無駄遣いだと怒られ、器具の洗浄は絶対やるようにと厳しく言われる日々です。 次はマウスから血液を抜くことを思いつかれたようで抜き方を勉強しておくように依頼されました。 注射針すら持ったこと無いのに。

(無題) 削除/引用 No.2944-17 - 2010/08/13 (金) 20:08:35 - mom-a >> 新しい種類のマウスを購入したらしくてネガコンはありません。 > >これを読んで皆さんグッタリなさったと思いますよ。前回のごたごたは何の教訓にもなっていなかったのでしょうか。 それを言っても無理でしょう。ここの書き込みや最近買ったばかりの本をつなぎ合わせて理解しようにも、それに十分な基礎知識がないわけですから。前回も、言われたことをきちんと消化はできていなかったと思います。 これが学生でしたら、「何を勉強してきた！」と怒るところですが、この方の場合は事情が違いますし。 >新しい種類のマウスを購入したらしくてネガコンはありません。 No.2944-12 に書きましたが、「１）水のみ（サンプルを入れずに、代わりに水を加える）」のPCRは何の試薬も追加購入せずに実験できますよね？No.2944-9でよっしーさんがおっしゃっているように、「PCRに使っている試薬のどれかに遺伝子がコンタミしている」場合は、これでもPCRでバンドが出ます。（もちろん、全サンプルでバンドが出ます。）これはやりましたか？やっていないのですか？ >２）以前にネガティブ（この場合は遺伝子なし）と判定されたマウスのサンプル あたらしく買ったマウスで初めたばかりなので、↑に当たるサンプルがないということでしょうか？あなたがチェックしている遺伝子を導入していないマウスを買えば良いのです。他の系統のマウスのサンプルでも良いから手元にあればやってみればいいです。 PCRが上手くいかなくてノンスペのバンドが出る、等の場合には１）ではバンドが出なくても、２）ではチェックしている遺伝子の当たりにもバンドが出てしまうこともあります。

(無題) 削除/引用 No.2944-16 - 2010/08/13 (金) 16:54:22 - 小言幸兵衛 > 新しい種類のマウスを購入したらしくてネガコンはありません。 これを読んで皆さんグッタリなさったと思いますよ。前回のごたごたは何の教訓にもなっていなかったのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2944-15 - 2010/08/13 (金) 16:17:23 - あんこ 新しい種類のマウスを購入したらしくてネガコンはありません。 マウスって思ったより種類が沢山いるんですね。 PCRを再度行いましたが同じ結果でした。 ただ、先生が器具の洗浄は必ず行うようにと言われているので、水をかけた後にエタノールで消毒しようと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2944-14 - 2010/08/11 (水) 12:01:28 - ちょこ > マウスは10匹を2回程度調べましたが、皆に遺伝子が確認されました。 ネガティブコントロールを加えてPCRをしましたか？ ネガティブコントロールありなら、その結果はどうでしたか？

(無題) 削除/引用 No.2944-13 - 2010/08/10 (火) 20:10:12 - 774 教授共々、前回のごたごたでコントロールの大切さを学ばなかったのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2944-12 - 2010/08/10 (火) 18:05:44 - mom-a >マウスは10匹を2回程度調べましたが、皆に遺伝子が確認されました。 >トランスジェニックマウスをヘテロ同士で交配し，変異遺伝子があるかないかのみの判定を行っていたら，計算上は4匹中3匹が遺伝子変異マウスになります。 マウス野郎さんがおっしゃる上のケースでしたら、10匹全部「遺伝子あり」になる可能性は十分にあると思います。だからといって、コンタミの可能性が否定できるわけではありませんが…。 よっしーさんのおっしゃるように、PCRの方のコンタミの可能性は結構あると思います。 私はジェノタイピングの際、下記の3種を必ず行うことにしています。 １）水（またはバッファー）のみ ２）以前にネガティブ（この場合は遺伝子なし）と判定されたマウスのサンプル ３）以前にポジティブ（この場合は遺伝子あり）と判定されたマウスのサンプル

お礼 削除/引用 No.2944-11 - 2010/08/10 (火) 14:48:04 - あんこ ご回答ありがとうございます。 KOマウスとは何でしょうか？すみません実は全くの素人補佐員でして･･･。 ネットで調べたら「ノックアウトマウス」だと出てきました。 私が調べているのは「トランスジェニックマウス」だそうです。 マウスは10匹を2回程度調べましたが、皆に遺伝子が確認されました。 それでOKなら申し分ないのですが。 プライマーは以前は上手く行きました。 今後はキムワイプでふき取るようにします。

(無題) 削除/引用 No.2944-10 - 2010/08/05 (木) 22:55:29 - マウス野郎 　私も尻尾切り派です。 　ハサミを拭いたりもしてません。 　大量のタイピングしてますが，ほぼ問題は起こったことがないです。 　あんこさんに伺いたいのですが， 　　１）遺伝子改変マウスとはトランスジェニックマウスですか？ 　　　　KOマウスですか？ 　　２）どういう状態で維持して，どういう方法で判定していますか？ 　　３）今回は何匹の遺伝子改変マウスをチェックなさったのでしょうか？ 　トランスジェニックマウスをヘテロ同士で交配し， 　変異遺伝子があるかないかのみの判定を行っていたら， 　計算上は4匹中3匹が遺伝子変異マウスになります。 　あくまでも確率の問題なので， 　５，６匹程度であれば全てが遺伝子変異マウスと判定されても 　不思議ではありません。 　20匹やって全て変異マウスであればコンタミなどについても 　考える必要があると思います 　KOマウスをヘテロ同士で交配し，PCRで2種類のバンドの位置で判定する方法であれば， 　プライマー濃度のバランスなどにより片方のバンドが全く見えなくなる時もあります。 　以前の判定ではうまくいっていたプライマーですか？ 　以前の判定に用いた野生型マウスのDNAは残っていますか？ 　残っていれば，これをコントロールとして用いるのもありだと思います。 　なくても，もう一度尻尾を切って，同時に確実に変異マウスではないマウスからも 　尻尾を切って同時にPCRを行ってみたら良いかと思います。

(無題) 削除/引用 No.2944-9 - 2010/08/03 (火) 20:15:25 - よっしー うちでは以前dNTPにヘテロのゲノムがコンタミしてましたね． PCRの試薬を全部新しくしてみればあっさり解決の様な気がします． うちでも尻尾切った剃刀をエタノール綿で拭くだけで， 判別付かなかったことはありません． 全くコンタミしていないかと言われれば???ですが・・・

お礼 削除/引用 No.2944-8 - 2010/08/03 (火) 19:11:38 - あんこ 洗浄しなくてもコンタミしないんですね。 勉強になりました。 先日、100%の確率で遺伝子変異マウスが誕生しました。 教授が絶対にコンタミしているから原因を探れとおっしゃったので、 考えられるとしたら耳パンチかと思いまして･･･。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2944-7 - 2010/08/03 (火) 10:08:01 - mom-a 私に最初に教えてくれた方はあああさんのように「特に洗浄していない」とのことでした。尾を切っている人も、いちいちメスを洗浄したり交換したりはしていない、と言っていました。100匹以上やっていると、いちいち洗浄していられない、というところなのかもしれませんが。 ですので、アルコールを使う場合は「念のため消毒」という意味合いがあるのかな、と思っていました。

(無題) 削除/引用 No.2944-6 - 2010/08/03 (火) 02:05:17 - b 多くのタンパク質やDNAは、アルコールの濃度によりますがアルコールに不溶です。 アルコールをかけると器具によけい沈着してコンタミの原因になるのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2944-5 - 2010/07/31 (土) 20:52:24 - mouse ちょっと的外れな回答を書きますが、私はear パンチ入れるのと同時にtailを5mm切り取ってgenotypingしています。5mmくらいなら血はでませんし、SPFコントロールがされていれば感染もしません。 パンチの切れ端を回収するのが手間なのと、コンタミがあるためです。 tailを切れないという条件ならごめんなさい。

お礼 削除/引用 No.2944-4 - 2010/07/28 (水) 16:33:43 - あんこ ご回答ありがとうございます。 アルコールをかけてキムワイプでふき取るようにします。

(無題) 削除/引用 No.2944-3 - 2010/07/28 (水) 15:52:43 - むむ 一匹ごとにアルコールを吹きかけてキムワイプで拭いていたにもかかわらず、コンタミして困ったことがあります。問題ない方もいらっしゃるので、きれいに拭けていなかったということだと思いますが、注意した方が良いかもしれませんよ。 構造的に、きれいに拭きにくいですよね。

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