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(無題) 削除/引用 No.2926-18 - 2010/07/24 (土) 16:13:39 - 制限酵素 私なら、インサートを切り出せる制限酵素で、多数のコロニーの混合物からのプラスミドを切って見ますね。 ほぼ一発で何が起こっているかわかると思いますけど。

(無題) 削除/引用 No.2926-17 - 2010/07/24 (土) 13:29:47 - ザンギ >2.なぜか薄めのblueコロニーに目的のインサートがある。 これの可能性が有りますね。 青白セレクションはあてになりません。 青白比とかインサートなしのライゲーションコントロールの白コロニー数とか 検討されてればわかると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.2926-16 - 2010/07/24 (土) 07:07:39 - Real-time 私の失敗から考えると 1.取り込めなかったplasmidをPCRで増幅してしまっている。 コロニーの無い寒天の部分をつついてコロニーPCRしたらバンドがしっかり出たことがありました。ただし2.1ｋｂのインサートが入ったTAクローニングベクターが他のインサート入りベクターより立体構造、GC比などによりPCRで増えにくいことが前提となります。これはミニプレップで解消するはずです。 2.なぜか薄めのblueコロニーに目的のインサートがある。 これはインサートが500bp以下で見られた現象で、2.1ｋｂでは見られない可能性大ですが。フレームシフト又はストップコドンの影響＞インサートのサイズの影響ではないかと思っています。 3.インサートから作られるたんぱく質に細胞毒性がある。 液体培地で培養中にインサートが抜けてしまうことがありました。理論的には寒天でもあるはずですが、寒天でこのようなトラブルに出会ったことがありません。TAクローニングはインサートの方向がランダムに決まるのでインサート内に長いパリンドロームでも無い限りこの可能性は極めて低いと思います。 可能性としては1>2>>>>3くらいと思っています。私の場合1kb位まではコロニーPCRで、2kb以上はミニプレップ＆制限酵素で確かめたくなります。

(無題) 削除/引用 No.2926-14 - 2010/07/23 (金) 19:23:13 - ファング 僕なら非特異増幅がないようにPCRの最適化をします。 ゲル抽しなくてもいいくらいになったら、スピンカラム精製だけして、ライ ゲーションに持っていきます。 ExTaqもクローニング目的にはお勧めしませんが、他の酵素では2kbpだとちょっと だけ難しいかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.2926-13 - 2010/07/23 (金) 17:55:27 - アザラシ 異伝子さん > T7、SP6プライマーを用いているということなのでこれらをインサート側のプライマーとして使用していて、ベクター側にもこれらのプライマーがあると、挿入方向や距離によっては100bpや500bpの短いフラグメントが優先的に増幅されても不思議ではありません。詳細はわからないので。 T7もしくはSP6がインサートプライマーとして非特異的に働いているという事ですか？ まだ確認していませんが、その可能性も考えられますね。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2926-12 - 2010/07/23 (金) 17:51:54 - アザラシ in situさん > PromegaのGo Taqで2kbちょいのインサートなら3分くらい伸長させます。 私も3分の伸長時間に設定して行いました。

(無題) 削除/引用 No.2926-11 - 2010/07/23 (金) 17:49:51 - アザラシ ファングさん > プロメガの緑色の酵素はエラーが多いので、クローンが取れてもシーケンスの読み直しをしたくなります。 クローンする前のPCRはTaKaRa Ex Taqを用いました。コロニーPCRの際にプロメガのGo Taqを使用しました。

(無題) 削除/引用 No.2926-10 - 2010/07/23 (金) 17:48:11 - アザラシ ***さん > PCRが阻害されてバンドが出ないことはありますが、バンドの長さが違うけど実は目的遺伝子が入っていましたということは少ないと思います。 私もそう思います。しかも、T7-SP6の組み合わせでPCRを行っているので、非特異的に結合したとも考えにくいと思っています。 > 入っている自信があるなら16個ミニプレップした方がよいと思います。 > もしくはプライマーをベクター/インサートのペアにしたほうがわかりやすいと思います。 そうですね。とりあえずミニプレップしてみます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2926-9 - 2010/07/23 (金) 16:09:07 - 異伝子 T7、SP6プライマーを用いているということなのでこれらをインサート側のプライマーとして使用していて、ベクター側にもこれらのプライマーがあると、挿入方向や距離によっては100bpや500bpの短いフラグメントが優先的に増幅されても不思議ではありません。詳細はわからないので。 インサート、ベクターとも理論上1箇所しか相同配列がないプライマーを使ってみては？

(無題) 削除/引用 No.2926-8 - 2010/07/23 (金) 15:45:42 - in situ 2kb超のインサートのサブクローニングで同様のことをやっています。 ただ、入っている向きも確認したいので、ベクター側のプライマーとインサート側のプライマーでコロニーPCRをやります。 長さが原因でPCRが走らなかったことは今まではないのですが、インサートが違うのでそういうこともあるかもしれません。 あと、少し気になるのがPCRの伸長反応の時間です。 菌量が多いと書かれていますが、コロニーPCRの場合通常のPCRよりもかなり夾雑物が多い条件なので、自分は伸長時間を少し多めにとるようにしています。 PromegaのGo Taqで2kbちょいのインサートなら3分くらい伸長させます。 あと >プロメガの緑色の酵素はエラーが多いので、クローンが取れてもシーケンスの >読み直しをしたくなります。 これは、確認のためのコロニーPCRをプロメガのGo Taqで行ったという意味だと思います。 Go Taqをサブクローニング目的に使うという発想はなかったんですが、やってる人いるんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2926-7 - 2010/07/23 (金) 15:21:17 - ファング PCR産物の精製過程で末端が劣化してTAクローニングできないことがあります。 切り出し過程のUV照射でDNAが損傷してクローニング出来ないことがあります。 プロメガの緑色の酵素はエラーが多いので、クローンが取れてもシーケンスの 読み直しをしたくなります。 菌量が多いと云々の話は聞いたことがありません。

(無題) 削除/引用 No.2926-6 - 2010/07/23 (金) 14:26:18 - *** PCRが阻害されてバンドが出ないことはありますが、バンドの長さが違うけど実は目的遺伝子が入っていましたということは少ないと思います。 目的遺伝子が入っているのに増幅されたバンドの長さが違うということはプライマ―が非特異的に結合していたということになります。 入っている自信があるなら16個ミニプレップした方がよいと思います。 もしくはプライマーをベクター/インサートのペアにしたほうがわかりやすいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2926-5 - 2010/07/23 (金) 14:07:30 - アザラシ 多分さん > 切り出しは完璧でなく、エチブロ等では見えないぐらい薄い色々な長さの断片が混じっています。長い断片（目的の断片）より短い断片の方が入りやすいので短いものが入ったものが多く取れたと思います。 ゲル抽出後、サンプルを電気泳動で確認したところハッキリとバンドが確認されました。短い断片の方がインサートされやすいのは分るのですが、目的産物のほうが濃度が濃いので16サンプル中1つでも入っているべきではないかと思うのですが・・・・。 > ベクター両端のプライマーを使ったとの事でしょうか？ T7、SP6プライマーを用いました。 > コロニーPCRで1kbp以上は増やしづらいので目的産物（2.1kb）がちゃんと入っていても判定出来ないのでは？と思います。 やはり1kbp以上は増やしづらいものなのですか？ > 菌量とはコンピの量でしょうか？ コロニーPCRの時ピックアップしたコロニーの菌量です。これがあまり多いと阻害されると過去ログに書いてあったので、これが原因なのかなぁと思っています。

(無題) 削除/引用 No.2926-3 - 2010/07/23 (金) 12:55:45 - 多分 切り出しは完璧でなく、エチブロ等では見えないぐらい薄い 色々な長さの断片が混じっています。 長い断片（目的の断片）より短い断片の方が入りやすいので短いものが 入ったものが多く取れたと思います。 また、目的の断片が大腸菌内でトキシックだった場合は更に目的の産物を得られにくいと思います。 >コロニーPCRで使用したプライマーはベクタープライマー ベクター両端のプライマーを使ったとの事でしょうか？ コロニーPCRで1kbp以上は増やしづらいので目的産物（2.1kb）がちゃんと入っていても判定出来ないのでは？と思います。 >菌量が多いのが原因であると思うのですが の菌量とはコンピの量でしょうか？

TAクローニングのインサート 削除/引用 No.2926-1 - 2010/07/23 (金) 11:10:27 - アザラシ Taq酵素を用いてPCRで目的産物(2.1kb)を増幅させました。非特異的増幅断片を確認したので、ゲル抽出を行いTAクローニングしました。その後大腸菌に形質転換し、白コロニーをコロニーPCRにかけました。 すると、ランダムに選んだ16コロニー全てにおいて目的サイズの増幅は確認できず、500bpも増幅や100bpの増幅といった各コロニーにおいてバラバラでした。 このフォーラムを読み返してコロニーPCRの際、菌量が多いのが原因であると思うのですが、菌量が多いと非特異的かつバラバラの断片となるのでしょうか？ ちなみに、コロニーPCRで使用したプライマーはベクタープライマーで、酵素はPromega社のGo Taq master mixをプロトコール通り使用しました。

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