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(無題) 削除/引用 No.2919-5 - 2010/07/27 (火) 11:32:38 - RH Tbさん ご意見ありがとうございます。 1wellに撒く細胞数を減らすと抗体産生細胞の数も減ってしまいますし、難しいところですね。 サブクローニングの回数を増やして頑張ってみます。

(無題) 削除/引用 No.2919-4 - 2010/07/22 (木) 04:19:30 - Tb 状況を聞いた印象では、１ウェル中に生えてきているクローン数が多すぎるのではと思います。フュージョン後、何プレートにまくのが適切かは、細胞・試薬・プロトコル・その人の腕によって異なるので、経験的に決めなくてはいけません。（メチルセルロース培地に撒いてコロニーを拾うことではじめからほぼシングルクローン化する方法もあります。これはこれでたいへんなのですが・・・） 現状、まだ抗体産生が見られるウェルの初期の細胞を凍結して持っているなら、そのこからできるだけたくさんサブクローニングして、ともかくも救い出すしかないと思います。100クローンとか。また、増殖が遅いクローンも拾うようにしてください。スクリーニングの方法によってはそれなりに力業になりますが、でも1st screeningをこなしたならば、サブクローニングもガンバです。 なお、限界希釈と表現した場合に、0.3〜3 cells/wellくらいにまく方法と、細胞数を数えずにともかく2倍、2倍、・・・、と連続希釈したものを複数列作る方法があります。私は前者を好んでいますが、後者がいいという人もいます。 もし、もっぱら増えてきているハイブリドーマが抗体非産生のもののようでしたら、抗体産生細胞の存在割合を見積もる方法として、anti-mouse Igκ-FITC + anti-mouse Igλ-FITCなどでintracellular stainingする方法があります。抗体産生している細胞が目的の抗体のものかどうかはわかりませんが、サブクローニングの時いくつのクローンをチェックすれば当たるか目安がつけられるでしょう。また、もしこの段階でほぼゼロ％になっていることがわかったならば、潔くそのウェルを切ることができます。

抗体産生Hybridomaの適切な培養方法 削除/引用 No.2919-1 - 2010/07/21 (水) 18:37:25 - RH モノクローナル抗体取得のために、Hybridomaの培養を行っております。 最近、抗体産生Hybridomaについて以下のような現象が起き、うまく培養できずに困っています。 ・1st screeningの際に抗体価が一時的に上昇するが（抗体産生Hybridomaが増殖するが）、すぐに抗体価が下がってしまう。 ・マスタープレートから限界希釈を行った際に、抗体非産生Hybridomaのみが増殖し、抗体産生Hybridomaが増殖してこない（もし増殖してもすぐに死滅してしまう）。 そのような現象を回避するための工夫や培養方法をご存知の方がいらっしゃれば教えていただけませんか？ 特にリン酸化部位に特異的な抗体を産生するHybridomaは死滅しやすい気がしますが、何か原因があるのでしょうか？ ちなみにこの実験で用いているHybridomaは、マウスの脾臓細胞とミエローマ細胞からPEGを用いて融合しています。 よろしくお願いします。

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