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(無題) 削除/引用 No.2909-13 - 2010/07/22 (木) 21:04:47 - Actias ､ﾊ､ｼｰkｬF､ｷ､ﾊ､ｫ､ﾃ､ｿ､ｫ｡｢､ﾋ､ﾏ､ｪﾖ�､ｱ､ﾋ､ﾊ､熙ﾞ､ｻ､�､ｬ｡｢･ﾗ･鬣ｹ･ﾟ･ﾉﾍｬ瓶県ﾈ�ﾓﾃ､ﾊ､鬘｢Novagen ､ｫ､鬢､､�､､､�･ﾙ･ｯ･ｿｩ`､ｬｳ�､ﾆ､､､ﾞ､ｹ｡｣Ori ﾟ`､､､ﾇ､､､�､､､�ｽM､ﾟｺﾏ､�､ｻ､ｬ､ﾇ､ｭ､ﾞ､ｹ｡｣ ､ｽ､ﾎ､ﾛ､ｫ､ﾋ､ﾏ｡｢ T. Yasukawa, C. Kanei-Ishii, T. Maekawa, J. Fujimoto, T. Yamamoto and S. Ishii, Increase of solubility of foreign proteins in Escherichia coli by coproduction of the bacterial thioredoxin, J. Biol. Chem. 270 (1995), pp. 25328ｨC25331. Y. Uchimura, M. Nakamura, K. Sugasawa, M. Nakao and H. Saitoh, Overproduction of eukaryotic SUMO-1- and SUMO-2-cojugated protein in Escherichia coli, Anal. Biochem. 331 (2004), pp. 204ｨC206. T. Murata, Y. Shinozuka, Y. Obata and K. K. Yokoyama, Phosphorylation of two eukaryotic transcription factors, Jun dimerization protein 2 and activation transcription factor 2, in Escherichia coli by Jun N-terminal kinase 1, Anal. Biochem. 376 (2008), pp. 115-121.

(無題) 削除/引用 No.2909-12 - 2010/07/22 (木) 13:49:58 - B4生 >take様 今行っている実験で大腸菌(BL21)を用いてある目的のタンパク質を生産させようとしています。 pGEXベクターのMCSに挿入し、GST融合タンパク質として目的タンパク質を生産させようとしているのですが、IPTGで誘導をかけてもバンドが出てこないので、分解されているのか、生産されてないのかよく分かっていない状態です。 このタンパク質に結合する酵素が１つ見つかっているのですが、これがこのタンパク質を安定化させるのではないかと思い、２つ同時に生産させれば目的タンパク質も安定化するのではないかと考えました。

(無題) 削除/引用 No.2909-11 - 2010/07/21 (水) 10:11:52 - Pumpkin >たちまちKmプラスミドだけになるでしょうね。 液培した場合には、私もこうなると思います。

(無題) 削除/引用 No.2909-10 - 2010/07/20 (火) 21:38:27 - take_ この質問に至った経緯に興味があります。

(無題) 削除/引用 No.2909-8 - 2010/07/20 (火) 19:43:50 - 中年 プラスミドの量はそれほど増やす必要があるようには思われません。形質転換効率はシングルの場合と比べてそれほど下がらないようです（competencyというのが一部の菌体のみの性質だからでしょうか？）。 ２種類の薬剤を入れておけば液培でも２つのプラスミドは維持されるはずだと思いますが、過去トピの内容をふまえると、２つのプラスミドのコピー数の比はコントロールできないし、それどころかコロニー毎にまちまちになるだろうと思われます。これが問題になるケースも当然あるでしょうね。また、アンピシリンは液培だとちょっと濁った程度で既に枯渇していますから（そして、それ以降はアンピシリンを足しても無駄ですから）、それ以上の濃度まで培養するならアンピシリン選択は皆無なのでたちまちKmプラスミドだけになるでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.2909-7 - 2010/07/20 (火) 18:47:14 - B4生 >中年様 過去トピありがとうございました 初めに自分が言ったやり方でやれば殆どコロニーは生えてこないのではないか、と担当教授が言われ自分でも無理かと思っていたので驚きました。 過去トピの実験を見るにプラスミド量はかなり多めに入れておいた方がいいんでしょうか？ あと、あの実験だけでは分からなかった事なんですが ２つのプラスミドが導入されたコロニーが出来た時、それを液体培養で(薬剤は２種類入れて)増やした時にそのプラスミドは維持されるとみなさんは思われますか？

(無題) 削除/引用 No.2909-6 - 2010/07/20 (火) 18:23:44 - ats 中年様 過去トピの紹介ありがとうございます。 Amp+Kmの組み合わせではないですがpUC系plamidを共存させた実験の経験はあります。私の場合、目的・コンストラクトが特殊だったせいか、目的は達成しましたが安定した結果は得られませんでした。 B4生さんの目的次第ですが、失敗したときの原因究明が出来ないようならお勧めしません。 なお、タンパク発現ベクターならpET系ベクターと共存可能なベクターがNovagen社からpDuetシリーズとして入手可能です。

(無題) 削除/引用 No.2909-5 - 2010/07/20 (火) 17:54:24 - Pumpkin 中年様 過去トピを読ませていただきました。なるほど、実に濃い討論があったようですね。認識を改めさせられる部分もありました。出典、ありがとうございます。

過去トピ 削除/引用 No.2909-4 - 2010/07/20 (火) 17:37:41 - 中年 プラスミドの不和合性については、過去トピでかなり濃い議論が行われたことがあります。実験をしてくださった方もありました。そこで学んだ私の理解は、不和合性はあくまでプラスミドの複製と分配の確率的な振る舞いから生じる現象であって、積極的な排除の仕組みがあるわけではないというものです。したがって、２種類の薬剤で選択を掛け続ける限り、２種類のプラスミドを持ったまま菌を維持することは可能であると思います。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;start=4;Code=3040

(無題) 削除/引用 No.2909-3 - 2010/07/20 (火) 16:32:37 - ats まず（不）和合性を理解してください。 例えばpUC origin（複製起点）由来の2種のplasmidを用いた場合、実際にはAmp+Kn 耐性のコロニーは得られると思います。ただし、不安定（どちらかを失いやすい）だと思いますので長期培養や保存は避けた方がよいでしょう。和合性のあるoriginを有したplasmidを使ってください。

(無題) 削除/引用 No.2909-2 - 2010/07/20 (火) 16:30:22 - Pumpkin >２種類のプラスミドを同じコンピテントセルに導入する事は可能でしょうか？ 結論から言えば可能ですが、grade 4の学生であれば、これらは教科書で学ぶことです。また、おそらくトピ主さんの考えている方法ではうまくいかないような気がする、と付け加えておきます。 プラスミドの定義（不和合性とか）やoriとかなんとか色々と勉強したうえで、答えを見出してください。

トランスフォーメーション 削除/引用 No.2909-1 - 2010/07/20 (火) 15:49:41 - B4生 ２種類のプラスミドを同じコンピテントセルに導入する事は可能でしょうか？ 例えば一つをAmp(アンピシリン)耐性のプラスミド、もう一つがKm(カナマイシン)耐性のプラスミドを使い、培地はAmpとKmを混合した培地を用いた場合、２種類のプラスミドが導入されたコロニーが出来てくるでしょうか？

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