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(無題) 削除/引用 No.2903-14 - 2010/07/21 (水) 16:01:01 - 花鳥風月 masaさま 設計ツールについて教えて下さり、有り難うございます。vectorについてはとりあえずは、手元にあるものを使ってみます。 sequenceが読みにくい点、アドバイス有り難うございます。大腸菌で増やす際にmutationが入りやすいって不思議、、、。なにか理由があるのでしょうか？？？ はまじさま Sigmaでは3/5で動いているとのこと、具体的な情報ありがとうございます。またaddgeneにあるpLKOのprotocolは詳しいですね！！　DMSOもなるほどです！！

補足です。 削除/引用 No.2903-13 - 2010/07/20 (火) 07:20:32 - はまじ たびたび申し訳ありません。 ＞10種類程度の遺伝子について実験をしましたが、少なくとも3つ程度は満足できる 1つの遺伝子につき5個のshRNAを試してうち3個程度は満足できると言う意味です。

SIGMAを使っています。 削除/引用 No.2903-12 - 2010/07/20 (火) 07:17:51 - はまじ 一つ前の投稿失礼いたしました。 前の方が書かれていたことの重複になります。私も使っていますよ程度の意見としてご参考ください。 私もSIGMAのshRNAを購入しています。以前は一つの遺伝子につき5個のshRNAをセットで買い、ノックダウン効率を調べて良い物を使っていました。今まで10種類程度の遺伝子について実験をしましたが、少なくとも3つ程度は満足できる効果が得られています（ひょっとすると興味を持たれている遺伝子をどのshRNAでノックダウンしたか、既に論文などに報告があるかもしれません）。私は購入していますが配列が公開されているので、自作は可能です。シーケンス確認の際はDMSOを加えると良いと思います。 使用されているプラスミドpLKO.1はAddgeneでお手軽価格で購入可能です。 http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&cmd=findpl&identifier=10878 作製の際は是非Addgeneサイト内のプロトコルを参照されると良いと思います。 http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&cmd=showcol&colid=170&page=2 レンチ用のベクターですが、当然このプラスミドのみのトランスフェクションでもワークします。293Tで確認しました。

SIGMA 削除/引用 No.2903-11 - 2010/07/20 (火) 06:59:41 - はまじ

(無題) 削除/引用 No.2903-10 - 2010/07/19 (月) 18:27:28 - masa 私はInvitrogen社の設計ツールを使っています。ループ部分の配列は他社由来のものを用いても問題ありません。oligoの注文は少しでも短い方が経済的によろしいと思いますので。 自作するとなると新しくベクターを購入されることになると思いますので自分の目的にあったものを選ばれるといいと思います。 予断ですが普通の発現ベクターの構築よりもシークエンスが読みにくかったり、大腸菌で増幅させる際にミューテーションが入りやすいなどのトラブルが起きやすいので注意されるといいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2903-9 - 2010/07/19 (月) 12:43:18 - 花鳥風月 masaさま、モモさま ご説明ありがとうございます。とりあえずは3種類ほど試してみるしかなさそうですね。各社のHPを参考にしながら自作してみようかな。 MPさま Sigmaはうまく行っているとのこと、情報ありがとうございます。自作する時にはまずはSigmaを参考にしてみますね。 HPを見ながら自作していこうと思いますが、設計ツールも参考にしたいと思い始めました。おすすめの設計ツールがありましたら、教えていただけないでしょうか？ 何度もすみません。宜しくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.2903-8 - 2010/07/18 (日) 21:33:12 - take_ >No.2903-6 公開している配列を使うことそのものは、研究に限定すれば、問題ないです。その配列に特許がかかっている場合でも、研究なら問題ないですが、製品化するのはリスキーかも。 ただし、（ビミョーな問題なので詳しい方の意見を聞きたいですが）特許のかかった配列を研究に使う場合、その配列にしたがって核酸合成する受託企業は特許侵害でしょうか？ 別の側面では、論文にするときになんと書くか困らないか、ということです。論文に載っているなら、引用すればいいだけですが、サイトでたまたま見つけた場合、そうとは書けません。 どうすればいいのでしょうね？

(無題) 削除/引用 No.2903-7 - 2010/07/18 (日) 13:52:06 - masa shRNAの配列を設計するアルゴリズムはいろいろあるみたいですが、どのメーカーでも70％位の成功率をうたっている感じではないでしょうか？ 某社の設計ツール等を参考に自作しても、ノックダウン未保障ものを購入してもやはり成功率は50-70％位だと思います。 ノックダウンを保障しているメーカーのでもオフターゲットを完全に検証しているわけではないので、自作or未保障のもので二配列以上ノックダウンできるものを見つけて実験に使用するのがいいのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2903-6 - 2010/07/18 (日) 08:14:52 - ぱ 横からすみません。 いくつかのメーカーは配列の情報をwebから得られたり、 この配列はノックダウンを確認済み、といった情報を得られますが、 こういったコマーシャルプロダクトを元に自作した場合って 特に問題になるようなことはないんでしょうか？ （特許や著作権ではないですが、メーカーの権利を侵害した、 といったような意味で）

(無題) 削除/引用 No.2903-5 - 2010/07/18 (日) 07:51:20 - MP Sigmaのものをけっこう使っていますが、大抵はよく抑えてくれます。ただ私が使っているのはレンチウイルスのシステムなので、通常のプラスミドでどうかはわかりません。あと値段がちょっと高い感じはします。配列が公表されているので自作するのもありかとは思います。

(無題) 削除/引用 No.2903-4 - 2010/07/17 (土) 23:34:34 - モモ Shのコンストラクトを一度だけ使ったことがありますが、配列に起因する部分は、３つ試してみてひとつがあたりという感じでした。みなさん、配列はいくつか試されることが多いんじゃないでしょうか。 それとは別に、コンストラクトの設計の部分は、自分の実験に合うやつを選ぶ必要があるんじゃないでしょうか？薬剤の選択とか、GFPのあるなしとか、ウイルスの種類や作製の方法など、いろいろと影響をうけますので。

(無題) 削除/引用 No.2903-3 - 2010/07/17 (土) 19:45:20 - 花鳥風月 Takeさま、コメントありがとうございます。 もしかして、各社で配列を選択する際のアルゴリズムが違うと、製品の質が違ってくるかと思ったのです。 あ、あと、私の文章を読み返してみますと、ちょっとわかりにくいですね。すみません。。。発現を抑制したい遺伝子は一つ決まっていて、その特定の遺伝子を抑えるshRNA plasmidを入手したいのです。 残念ですが、PubMedではその遺伝子をshRNAで抑制している論文がなかったんです....

(無題) 削除/引用 No.2903-2 - 2010/07/17 (土) 17:21:52 - take_ 抗体と同じと思います。 効きがいいもの悪いもの。 非特異の影響が高いもの低いもの。 それぞれ独立の事象と思ったほうが良い。 効き目の保証はカタログデータから判断するしかないですが、 非特異の影響は、使ってみるしかないかも。 効き目保証の高いものを少しだけ買うか、 保証無しの安いものを当りが出るまで買うか。 迷います。 ぼくなら、保証無しの安いものを当りが出るまでです。 抗体と違って、同じ配列なら、どこの会社も同じ品質と思うので（なんとなく）。

市販のshRNAベクター 削除/引用 No.2903-1 - 2010/07/17 (土) 14:50:51 - 花鳥風月 もし以前に同様なトピックが出ていたらすみません。ご指摘いただければ幸いです。 初めてshRNAの実験を使用としています。ある目的遺伝子（マウスの転写因子）の発現を抑えるベクターを入手したいのですが、各社から販売されていて、どの会社のshRNA vectorが良いのか迷っています。会社によって、特異性や発現抑制などのshRNAの質の違いはあるのでしょうか？　それとも一般的なことを言うのは難しいでしょうか？ 抗体を購入する場合は「××社だと外れが多い」などという噂を聞きます。shRNA vectorの場合でも会社ごとの質の違いがあるのかなと思ってお聞きしたいと思いました。 もちろん、購入後はちゃんとチェックしてから使いたいと思いますが、できれば、最初から質の良いものから始めたいと思っています。 経験のおありの方がいらっしゃれば、教えていただければ助かります。宜しくお願いいたします。

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