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(無題) 削除/引用 No.2895-21 - 2010/07/23 (金) 09:16:08 - Boston > 　もう一つここで説明しなかった点は、この薬剤はとあるトランスジーンを持っている細胞（Tg)だけに効くことになっています。 立ち上げているシステムは分かりました。友人はその薬剤を in vivo、in vitro で使用しています。濃度決定に時間をかけたくらいで、さほど苦労していません。 やはり BrdU の安定性、DNA への取り込み効率、検出法のどこかに問題があると考えるのが妥当だと思います。

(無題) 削除/引用 No.2895-20 - 2010/07/21 (水) 23:31:04 - 通りすがり >僕なら、初めて使ったほうが問題か、その組み合わせが問題か、は並行で検討しますけどね。 　組み合わせが問題、というのがこの場合具体的にどういうことなのかわかりません。（別に混ぜて使ったわけではないので) 　今まで何度も使っていて、自分の仮説に合う結果を出している試薬、一方、初めて使い、自分の仮説と違う結果を出した試薬。この場合、初めて使った試薬の使い方があっているかどうか調べたくなるのは普通だと思います。

僕なら 削除/引用 No.2895-19 - 2010/07/21 (水) 23:15:33 - ami > いつもよく使っている試薬と、初めての試薬を組み合わせて、問題が生じたら、初めて使ったほうを疑うのは自然と思いますよ。 僕なら、初めて使ったほうが問題か、その組み合わせが問題か、は並行で検討しますけどね。

(無題) 削除/引用 No.2895-18 - 2010/07/21 (水) 22:57:23 - 通りすがり 　そろそろ終わりにします。皆様ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2895-17 - 2010/07/21 (水) 22:08:26 - 通りすがり >だから、どうしてBrdUは安定性を疑うなど信じなくて、もう１つの薬剤は信じるのかという 疑問があると言っている人がいると思うのです。 　BrdUだけを疑っているわけではないですよ。あえていえば、自分のBrdUの使用方法が正しいかどうかを疑っているのです。以前にも書きましたが、BrdUをIn vitroで使ったのは初めてだったので、使用方法が間違っているのではないかと考えたのです。 　もう一つの薬剤に関しては、使用条件が完全に最適かどうかはわかりません。ただ、細胞死を誘導することが知られている薬剤を用いて、細胞死が実際に誘導された（細胞数が６５％減少した)のですから、この薬剤が劣化しているようなことは疑っていません。 　もう一つここで説明しなかった点は、この薬剤はとあるトランスジーンを持っている細胞（Tg)だけに効くことになっています。これがない細胞（Wt)には細胞死を誘導しないことになっています。私はTgとWtの両方にこの薬剤を投与し、Wtに細胞死を誘導しない（細胞数が減らない)ということをコントロールで確認しています。従いまして、この薬剤が無差別に細胞死を引き起こしているという可能性は考えていません。 　繰り返しますが、私はBrdU自体に疑問を持っているのではないのです。自分自身のBrdUの使用方法に疑問を持ったのです。いつもよく使っている試薬と、初めての試薬を組み合わせて、問題が生じたら、初めて使ったほうを疑うのは自然と思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.2895-16 - 2010/07/21 (水) 14:40:36 - だから ＞これも、実は、この試薬というのは細胞死誘導に一般的に使われているものなのです。私たちが開発したり、発見したりしたものではないのです。（ただ、これも説明不足でした) BrdUも一般的に使われているものです。 だから、どうしてBrdUは安定性を疑うなど信じなくて、もう１つの薬剤は信じるのかという 疑問があると言っている人がいると思うのです。

(無題) 削除/引用 No.2895-15 - 2010/07/20 (火) 23:54:45 - 通りすがり ＞その細胞の増殖曲線を自分で書いた事ありますか？細胞播種２日後に細胞数が２倍以上になっているのに、BrdU 陽性細胞が 30% 程度であれば、検出法（感度を含め）や BrdU の安定性を疑ってもよいかと思います。 　増殖曲線は書いたことがないです。大体の印象ですが、初代培養だからか、２日間が短いのか、底にくっつかずに死ぬ細胞も多く、２倍にはなっていないような印象です。 　確かに、細胞数の増加を見れば、BrdU取り込み細胞の率が正しいかどうかの指標になりますね。大変参考になりました。ありがとうございます。 　 ＞5-FU とかは水溶液中で不安定で、凍結保存するように友人から教わった記憶があります。 　BrdUの水溶液（原液)は冷蔵庫でかなり長く(少なくとも週単位)持つようです。なので、もし仮に、培地中でBrdUが不安定とすれば、それは３７度という温度か、細胞の存在によるものか、培地成分によるものか、ということになると思います。 ＞ちなみに、BrdU を検出する際、塩酸処理していますか？ 　これは大丈夫です。In vivo(切片)でも行っていて、そのプロトコルを細胞染色に応用しましたので。

(無題) 削除/引用 No.2895-13 - 2010/07/20 (火) 15:45:04 - Boston その細胞の増殖曲線を自分で書いた事ありますか？細胞播種２日後に細胞数が２倍以上になっているのに、BrdU 陽性細胞が 30% 程度であれば、検出法（感度を含め）や BrdU の安定性を疑ってもよいかと思います。 5-FU とかは水溶液中で不安定で、凍結保存するように友人から教わった記憶があります。 ちなみに、BrdU を検出する際、塩酸処理していますか？

(無題) 削除/引用 No.2895-12 - 2010/07/18 (日) 08:07:13 - 通りすがり ＞ま、私がどうして前のような書き込みをしたかというと、違和感があったからです。 　いえいえ、一番悪かったのは、私の説明が半端だったためです。当初は、「BrdUって培地中で壊れますか？｣だけ書こうかと思ったのですが、それだとあまりにそっけなすぎて失礼かなと思いました。そこで、プロジェクト自身の説明を少しだけ添えたのですが、それが不十分すぎて、いろいろとご迷惑をおかけしました。半端がよくなかったですね。全く背景を書かなかったほうがまだよかったかもしれません。 ＞「自分の試薬は理想通りの効果があるはず、他の実験でそれを証明できないのはその他の実験がおかしいからだ」こういう考えが前提にあると感じたからです。 　これも、実は、この試薬というのは細胞死誘導に一般的に使われているものなのです。私たちが開発したり、発見したりしたものではないのです。（ただ、これも説明不足でした) ＞今回の実験がBrdUの使用でまず間違いないと言っている割には、思った結果でないと、信用しない。これまで細胞周期をみるときの実験としてかなり使われている方法であるという実績があるのに。 　いえいえ、BrdUは一般的な方法として信用しています。ただ、In vivoの使用経験しかなかったので、In vitroでは使用法に別の常識があるのかと急に不安になり、当初の質問をしたのです。 ＞どうして、「BrdU陽性細胞は３０％ちょっと」という結果が真実なのかもしれないという可能性をあたまから否定して、疑うのは、即「BrdUの安定性」なのか、という違和感です。 　これもいろいろある可能性を考えた上で思いついた一つの可能性を質問したものです。BrdUの使用法（投与方法、濃度)が正しいならば、別に３０％を無理に疑うつもりはないです。 ＞その薬剤を「分裂が盛んなガン細胞に効く薬」とかなんとかで アピールしたいとかなのでしょうが、 　これは、違います。以前の書き込みに書いたように、「最終的な目的は、分裂する細胞のみを除去し、Phenotypeを見て、その細胞(特に分裂脳のある細胞)の機能を探る」です。ノックアウトマウスを使ってその分子の機能を探るのと同じ発想です。 　これはすでに普及している細胞死誘導技術ですので、私たちがアピールするということはありません。 ＞「BrdU陽性細胞は３０％ちょっと」が信用できないというのなら、 安定性がどうとかいうより、他の方法で65%が分裂している細胞って 示す結果を探し出せばいいのではないでしょうか。 　これはそのとおりですね。ただ、BrdUはかなり一般的なものなので、第一候補として選んでみました。

(無題) 削除/引用 No.2895-11 - 2010/07/17 (土) 23:17:43 - う ま、私がどうして前のような書き込みをしたかというと、違和感があったからです。 「自分の試薬は理想通りの効果があるはず、他の実験でそれを証明できないのは その他の実験がおかしいからだ」 こういう考えが前提にあると感じたからです。 どうしてそういう結論に達したかは、書き込むと長くなるので書かないのでしょうし、 書き込まなくても結構なのですが、 今回の実験がBrdUの使用でまず間違いないと言っている割には、思った結果でないと、信用しない。 これまで細胞周期をみるときの実験としてかなり使われている方法であるという実績があるのに。 どうして、「BrdU陽性細胞は３０％ちょっと」という結果が真実なのかもしれないという可能性をあたまから否定して、疑うのは、即「BrdUの安定性」なのか、という違和感です。 まぁ、確かに、BrdUの安定性について質問しているのだから、私は余計なことですけど。 その薬剤を「分裂が盛んなガン細胞に効く薬」とかなんとかで アピールしたいとかなのでしょうが、 「BrdU陽性細胞は３０％ちょっと」が信用できないというのなら、 安定性がどうとかいうより、他の方法で65%が分裂している細胞って 示す結果を探し出せばいいのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2895-10 - 2010/07/16 (金) 23:11:20 - 通りすがり >BrdUも長期間作用させると細胞が死ぬときがあります。このことから、初期にBrdUを取り込んだ細胞は死んで浮いたため洗い等で（計数から）排除されて、BrdU曝露後期に取り込んだ細胞のみ観察している可能性はないでしょうか。 　これはかなりありうると思います。BrdUは濃くしすぎると細胞が死ぬし、薄すぎると検出が難しくなりますよね。私が採用した10 uMは他の複数の論文を参考にしたので、そんなに間違った数字ではないと思うのですが、それでも細胞死を引き起こしている可能性はあると思います。 　もしこの疑問に決着をつけるとすれば、BrdUあり、なしで細胞数に変化があるか調べる必要があるでしょうね。 　今回、多くの方からたくさんの書き込みをいただいたにもかかわらず、「培地中でBrdUは減っていくよ」というご指摘がなかったことは、やはり原因が他にあるということなのかもしれません。そして、それ以外の可能性の中で一番ありそうなのがatsさんの上記のご意見かと思います。

(無題) 削除/引用 No.2895-9 - 2010/07/16 (金) 14:47:30 - ats BrdUも長期間作用させると細胞が死ぬときがあります。このことから、初期にBrdUを取り込んだ細胞は死んで浮いたため洗い等で（計数から）排除されて、BrdU曝露後期に取り込んだ細胞のみ観察している可能性はないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2895-8 - 2010/07/16 (金) 11:53:07 - 通りすがり atsさん、takeさん 　もう本当に申し訳ないです。説明が下手なんですね。説明を中途半端に書いてしまったから、皆さんに余計な手間をおかけしてしまって。 ＞「In vivo」 でBrdU が代謝されるとき、どこで代謝されますか？ そのメカニズムは？ 　なんとなく肝臓かなと思っていました。なので、In vitroでは大丈夫だと思い込んでいたのです。正確なことは知りません。これから少し調べてみます。 ＞No.2895-1 で言っている「別種の実験」って何ですか？ 　これは、２８９５-３で書いた、細胞死誘導実験です。BrdUと同じような機序で取り込まれる(細胞死誘導）薬剤を用いたところ、６５％の細胞が死にました。（実際には、細胞数の減少で見ています) ＞BrdU とりこみと同時並行で行った実験ですか？ 「別種の実験」とBrdU 取り込みは、同じ細胞（厳密に同一一個ずつの）で、結果を見ることができますか？ 　BrdUともう一つの薬剤は別に行っている実験です。細胞を別に用意し、同じタイムコースで比較しています。２つの試薬を混ぜてはいません。 　確かに、死んだ細胞でBrdUを検出できれば、面白いと思います。気づきませんでした。 ＞細胞への取り込み・代謝において競合しないかな。 　説明が下手ですみませんでした。両者は混ぜていません。独立した実験です。

(無題) 削除/引用 No.2895-7 - 2010/07/16 (金) 09:40:12 - ats ＞（BrdUのように）M期にDNAに取り込まれる薬剤（チミジンのアナログです） だとすると、細胞への取り込み・代謝において競合しないかな。細胞が十分な取り込み能力をもっていれば（両者を競合せず取り込めるなら）問題無いでしょうけど、検討は不要でしょうか。 言い換えると、「BrdUを取り込む前に有効濃度の薬剤を取り込んで死んでしまう」ことはないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2895-6 - 2010/07/16 (金) 08:54:08 - take_ 示唆でなく質問です。 「In vivo」 でBrdU が代謝されるとき、どこで代謝されますか？ そのメカニズムは？ No.2895-1 で言っている「別種の実験」って何ですか？ BrdU とりこみと同時並行で行った実験ですか？ 「別種の実験」とBrdU 取り込みは、同じ細胞（厳密に同一一個ずつの）で、結果を見ることができますか？

(無題) 削除/引用 No.2895-5 - 2010/07/16 (金) 08:47:16 - 通りすがり >そのDNAに取り込まれる薬剤とやらが、単純に、別の毒性を持っていて 細胞が死ぬってことではないですか。 よくあることです。 　すみません、よく意味がわからないです。おそらく、私の説明が不足なのだと思います。 　私のプロジェクトは、細胞分裂の研究ではありません。（BrdUのように）M期にDNAに取り込まれる薬剤（チミジンのアナログです）を細胞に投与します。この薬剤は、取り込まれた細胞に細胞死を誘導する性質があります。最終的な目的は、分裂する細胞のみを除去し、Phonotypeを見て、その細胞(特に分裂脳のある細胞)の機能を探るというものです。 　このプロジェクトの初期のステップとして、分裂している細胞にどの程度細胞死を誘導できているのか知りたいのです。分裂していない細胞を殺さずに、分裂する細胞はすべて殺すような環境を作りたいのです。 　そこで、実際に細胞死を誘導するべく薬剤を投与したところ、６５％が死にました。もし、この細胞群の６５％が分裂する細胞であるならば、実験成功ということになります。 　そこでそれを確かめるために、ごくごく簡単な実験として、BrdU投与を考えました。BrdUを取り込む細胞数が全体の６５％だったら理想的なわけです。しかし、実際は３５％でした。誤差を考えても、これはちょっと低すぎると感じています。 　そこで思いついたのが、BrdUが壊れてしまったのかということです。Vivoだと、半減期は１５分とか３０分とかだと思うのですが、VitroだとVivoのように代謝されないと思い込んでこの実験を始めたのです。 　こういう経緯で、この質問を立てました。 ＞私は、なぜBrdUの安定性を疑う前に、その薬剤が別の毒性で死んでいることを疑わないのかが不思議です。 　若干わかりにくいのですが、これはその薬剤が、非分裂細胞も間違えて（？）殺してしまっている可能性のことでしょうか。・・・実は、この可能性は、あるコントロール群を用意することで排除できています。（この話をするとメチャメチャ長いので省いちゃいました） ＞BrdUの安定性を疑う前に、他の細胞分裂を解析する方法はいくらでもあるのですから、 BrdU以外の解析も行なった結果を見てから、BrdUの安定性を疑った方が建設的だと思います。 　BrdUを選んだのは、その薬剤と取り込みの機序が近いと思ったからです。この書き方から察するに、BrdUは培地中では２日間くらいは安定ということなのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2895-4 - 2010/07/16 (金) 07:49:30 - う そのDNAに取り込まれる薬剤とやらが、単純に、別の毒性を持っていて 細胞が死ぬってことではないですか。 よくあることです。 ＞その薬剤とBrdUの取り込み効率が同じとすると、BrdUを取り込む細胞も同じくらいなくてはならないです。 私は、なぜBrdUの安定性を疑う前に、その薬剤が別の毒性で死んでいることを疑わないのかが 不思議です。 BrdUの安定性を疑う前に、他の細胞分裂を解析する方法はいくらでもあるのですから、 BrdU以外の解析も行なった結果を見てから、BrdUの安定性を疑った方が建設的だと思います。

(無題) 削除/引用 No.2895-3 - 2010/07/16 (金) 03:26:22 - 通りすがり >BrdUはDNA synthesisのマーカーであり、分裂のマーカーではありません。 分裂がみたければ、CFSE-labelでFACSでみることはできないんですか。 　なるほど。確かに、DNAが痛んでそれを修復するときにもBrdUが取り込まれるとか聞いたことがあります。ただ、ざっくりと大雑把に、分裂（より厳密には、投与中にM期を経た細胞)のマーカーとして使うことはできないでしょうか。 　ところで、少し説明不足があったのですが、今回の実験系については、BrdUの使用でまず問題ありません。実は、これは細胞死を誘導するというメインテーマを補完する実験なのです。その細胞死誘導は薬剤を使うのですが、その薬剤はBrdUのように、DNA合成時にDNAに取り込まれるというものです。その実験を行ったところ、約６５％の細胞が死ぬとわかりました。その薬剤とBrdUの取り込み効率が同じとすると、BrdUを取り込む細胞も同じくらいなくてはならないです。しかし、実際はBrdU陽性細胞は３０％ちょっとでした。誤差を考えても、少し差が大きすぎます。 　BrdUの濃度は10 uMなのですが、もしこれが高すぎる場合、それでも説明はつきますね。 　あともう一つの可能性は、最初に質問させていただいたように、BrdUがその薬剤に比べて不安定で、２日間投与中の後半にほとんどなくなっている、ということかと考えたのです。

(無題) 削除/引用 No.2895-2 - 2010/07/16 (金) 02:11:19 - TK-1 BrdUはDNA synthesisのマーカーであり、分裂のマーカーではありません。 分裂がみたければ、CFSE-labelでFACSでみることはできないんですか。

In vitroでのBrdUの安定性 削除/引用 No.2895-1 - 2010/07/16 (金) 00:57:41 - 通りすがり 　ある初代培養細胞の中で分裂しているものの割合を知りたく、次のような実験をデザインしました。 　Day０に細胞を撒き、同時にMediumにBrdUも入れておく。途中でMediumは変えることなく、Day２で細胞を固定、BrdUを免疫染色し、分裂している細胞の割合を算出。(Day０からDay２としたのは、他の実験との整合性のため) 　非常に単純な実験なのですが、この結果、約4割の細胞がBrdU陽性でした。そして、約4割の細胞が2日間の間に分裂をしていると結論付けました。 　ところが、別種の実験の結果は、6割から7割の細胞が分裂することを示唆していて、少し結果にギャップが生じています。 　そこで具体的な質問なのですが、上記の実験でBrdUが変性する（つまり減っていく)ということはありますか？In vivoの場合は、BrdUはすぐに代謝されてしまうことは知っています。In vitro(37度)でも二日間、培地や細胞と一緒にあることで、BrdUは急激に減ってしまうものでしょうか。一般的なこととしてご存知の方がいたら教えていただけますでしょうか。

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