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(無題) 削除/引用 No.2894-6 - 2010/07/20 (火) 12:40:27 - Boston >[Re:5] 　名無しさんは書きました : トリプシン処理せずに細胞を剥がすとき、どのようにして細胞を単一細胞にして均一に分散させるのかが分かりません。この点について、提案者の考えている方法を明日学校行ったら聞いてみましょう。 答えになってしまいますが、、、、 浮遊細胞も回収するというのが提案者の意図だと思います。

(無題) 削除/引用 No.2894-5 - 2010/07/19 (月) 19:11:34 - 　名無し 細胞膜の蛋白質を標識するならば生きた状態でできますが、細胞内の蛋白質やDNAを標識する場合は細胞膜を一部壊さないと抗体や試薬が中に入らないので、まず固定、膜の透過処理、などを行う必要があるので、結果として死んだ細胞をFACS解析する事になります。ただ固定したその時点で細胞内の諸反応は一応は不可逆的にフリーズしたと考えてよいとおもうので｀｀死んだ細胞｀｀をFACSすること自体はおかしなことでなく実際普通に行われます。 原理を勉強してもらうと分かるとおもいますが、FACSでは細胞が単一細胞になっていて試料が均一な溶液であることが重要なポイントになります。細胞の小さなアグリゲートがまだ残っていたり一部の細胞がチューブの底に沈んでいたりすると正しい測定は出来ないですし、ラインの詰まりの原因にもなります。トリプシン処理せずに細胞を剥がすとき、どのようにして細胞を単一細胞にして均一に分散させるのかが分かりません。この点について、提案者の考えている方法を明日学校行ったら聞いてみましょう。 急がば回れでで、100%理解出来なくてもいいのでFACSの原理を一度は勉強することを勧めます。いろいろ入門書がでてますしネットでも役立つサイトはあります。たとえば(http://www6.tok2.com/home/yukiso/kyo3/facs/facsgaid/FAgaid.html)の3.1〜4.2の項。 取りあえず入門書１冊通読するだけでも全然違います。 メーカーの方にもライフサイエンスの専門家はいますので、問い合わせてみると基本的な事からかなり深い内容まで親切に教えてくれる事が多いです。

(無題) 削除/引用 No.2894-3 - 2010/07/16 (金) 08:43:16 - take_ 標準かどうかともかく、ぼくのヒントは、 「洗ってから解析すると．．．．培地ごと回収すると．．．．」 amiさんも言っているように、 「さらに詳しく聞くか、自分で考えるか」 ぼくのヒントはともかく、あなたにそういった人に聞いてください。 聞いた上で違うと思ったら、「その人に」意見なり疑問なりぶつけてください。 ここの皆さんは、懇切丁寧に答えてくださっていますが、１週間、１ヶ月後に、全員が同じ密度であなたに接することができるかどうかはわかりません。 同じラボの「その人」は、明日もあさっても、同じ密度で接してくれるでしょう。 あなたとその人の間で、解決してください。

(無題) 削除/引用 No.2894-2 - 2010/07/15 (木) 23:28:13 - ami ＞提案された方に同じ質問をしたのですが、そのようにしないと”差”は見えないと言われたのですが・・・。 さらに詳しく聞くか、自分で考えるかです、まずは。

細胞周期解析（FMC） 削除/引用 No.2894-1 - 2010/07/15 (木) 23:19:40 - G2 スクリーニングされたある薬剤をHepG2に添加すると４８時間後には細胞が７５％死にます。そのメカニズム解析の一つとして細胞周期をFACSで解析しようとしています。薬剤添加後８，２４，４８時間で培養上清を抜く→細胞をトリプシンにより剥がす→固定→PI染色→FACSというフローで行う予定ですが、各タイムポイントで培養上清を抜かずに合わせて回収して固定→PI→FACSするようにと提案されたのですが・・・・・なんか腑に落ちないのですが・・・これは標準的なプロトコールなのでしょうか？提案された方に同じ質問をしたのですが、そのようにしないと”差”は見えないと言われたのですが・・・。 FACSは素人なのですが、未だに？なので（死んだ細胞を解析しても・・・）どなたか教えて頂けないでしょうか？

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