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(無題) 削除/引用 No.2892-14 - 2010/07/16 (金) 06:27:56 - ｙｔ 組織切片を対象にしたじっけんですよね？ スライスカルチャーでトランスフェクションするのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2892-13 - 2010/07/15 (木) 23:40:53 - みならい たびたびのお返事恐れ入ります。 >中年様 ご指摘いただいたように全長でトランスエンドサイトーシスが起きればいいのですが、この受容体は細胞内ドメインが核内へ移行することで下流にシグナルを伝えるため全長のトランスエンドサイトーシスは期待できないと思われます。 ですが、ご指摘いただけたような系統の論文はヒントになりそうな気がします。 >susu様 ご指摘ありがとうございます。非常に参考になりました。 CypHer5E(GE healthcare)については勉強不足でまったく知りませんでした。 商品化されているのはCypHer5Eで標識された抗体と特異抗原の発現ベクターを用いる方法のようですが、このような色素を標識した抗-細胞外ドメイン抗体を用いてスライス培養などすれば観察できるかもしれません。 通りすがり様からもご意見いただきましたがpH依存性の発色色素がどうやら有望そうですね。

(無題) 削除/引用 No.2892-12 - 2010/07/15 (木) 19:38:15 - susu CypHer5E(GE healthcare)はどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2892-11 - 2010/07/15 (木) 18:49:56 - 中年 CD47の場合は細胞外ドメインが切れないで全長がトランスエンドサイトーシスされるようなので、細胞質領域をGFPなどで標識する手が使えるようですが、ご覧になっている系ではそうではないんですね。切れない変異体もトランスエンドサイトーシスされるってことは期待できないでしょうか。 http://jcs.biologists.org/cgi/content/full/121/8/1213

(無題) 削除/引用 No.2892-10 - 2010/07/15 (木) 17:53:31 - みならい >中年様 in situ様 私の説明が拙いため勘違いをさせてしまい申し訳ありません。 なかなか該当するような技術を用いた論文にあたりませんのであまりないのかもしれません。(逆に技術を作れば論文になるかもでしょうか？(笑

(無題) 削除/引用 No.2892-9 - 2010/07/15 (木) 17:30:08 - in situ 自分も中年様と同様の勘違いをしていたようです。 申し訳ありません。 前述の手技は、培養細胞で取り込みの過程をリアルタイムで追うのに使われていたものなので、対象が組織で、細胞内で合成されるようなものだと厳しいかもしれません。 しかも、組織だとtransfectionも難しいですし、標識も簡単にはできませんね… ちょっと更なる案がすぐには浮かびません。すいません。

(無題) 削除/引用 No.2892-8 - 2010/07/15 (木) 16:21:10 - 中年 すみません。リガンド提示細胞に取り込まれるんですね。すっかり勘違いしていました。私の的外れなコメントはお忘れ下さい。

(無題) 削除/引用 No.2892-7 - 2010/07/15 (木) 14:52:27 - みならい ＞中年様 組織切片上で確認してリガンドを提示している細胞種の特定を目指したいと考えています。(受容体の細胞外ドメインはシグナル伝達後に切断されリガンド提示細胞に取り込まれます。) 細胞種ごとの単離が大変だと予想されますのでウェスタンは難しいのではないかと考えていますがいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2892-6 - 2010/07/15 (木) 14:43:12 - みならい 早速のお返事いただきありがとうございます。 ＞通りすがり様 確かに、pHで発光する色素は使えるかもしれません。 原理をよく読んで検討したいと思います。 ＞in situ　様 基質を別で取り込ませておく方法ですが、細胞内で受容体タンパク質が合成されるときにも発色したりしないものでしょうか？ 答えようのない質問かもしれませんがもし何かわかりましたらお答えいただけると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.2892-5 - 2010/07/15 (木) 14:29:25 - 中年 リアルタイムでモニターしたいんですか？そうでなくても良いなら、受容体の細胞質領域にGFPを融合しておいて、エンドサイトーシスされてリソソームで分解されることで生じる（プロテアーゼ耐性の）GFP単体のバンドをウェスタンで確認するという方法がよく使われているように思います。

(無題) 削除/引用 No.2892-4 - 2010/07/15 (木) 14:17:04 - in situ ちょっとうろおぼえで申し訳ないのですが、細胞内に蛍光を発するのに必要な基質を取り込ませておいて、細胞外にある標的分子を蛍光分子で標識。 取り込まれると光る。 というシステムがあったように思います。 あいまいですいませんが、参考までに。

(無題) 削除/引用 No.2892-3 - 2010/07/15 (木) 13:57:16 - 通りがかり リソソームで分解されるなら、 http://www.invitrogen.jp/mp/pHrodo.shtml が使えるかも。

(無題) 削除/引用 No.2892-2 - 2010/07/15 (木) 13:48:31 - それは 無理。

エンドサイトーシスで取り込まれるタンパクの標識 削除/引用 No.2892-1 - 2010/07/15 (木) 12:44:22 - みならい いつもお世話になっております。 皆様にご意見を伺いたいのですが、 1回膜貫通型の受容体で、シグナル伝達後に細胞外ドメインがシグナル提示細胞にエンドサイトーシスにより取り込まれる膜タンパク質について、細胞外ドメインを標識することでシグナル提示細胞の特定ができないかと考えているのですが、このような目的の場合どのような標識方法が適していますでしょうか？ エンドサイトーシスのあとは、取り込まれた細胞外ドメインは直ちに分解を受けると考えられています。どのくらいの数の分子が実際に取り込まれているのかは不明で現在論文を漁っているところです。 できれば、シグナルを受容していない(切断されていない細胞外ドメイン)は検出しない様な系にしたいと考えています。 イメージとしてはTaqmanプローブのように切断されると蛍光が出るようなタンパク質を作れれば取り込んだ細胞だけを見ることができそうだと思うのですが・・・ 勉強不足のみで恐縮ですが、皆様のお力をお貸しください。 よろしくお願いします。

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