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(無題) 削除/引用 No.2888-6 - 2010/07/16 (金) 08:56:24 - 通りすがり ＞電顕用の固定では、まだまだGA単独固定も使われていると思いますよ。 　私がTris−GAが禁忌ということを習ったのは電顕の専門が多い研究室でした。 　これですべてすっきりしました。ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.2888-5 - 2010/07/16 (金) 08:31:07 - 組織 >ひょっとしたら、GA単体だけを用いる（PFAと組み合わせない)実験というものが実はよくあるのか 電顕用の固定では、まだまだGA単独固定も使われていると思いますよ。ただ、GAは浸透性が悪いので、組織が大きい場合など、PFAを混ぜて使う（いわゆるカルノフスキー液）ケースが多いかもしれませんね。いずれにしても、電顕分野ではGAが第一選択になり得るということです。 GAやPFAをTrisで作るというのは、さすがに聞いたことないですねぇ。このトピックを見て、一度試してみたいという興味はわいてきました。

(無題) 削除/引用 No.2888-4 - 2010/07/15 (木) 20:08:50 - 通りすがり 　APさん、名無しさん、ありがとうございます。 　やはり、私が思い出したかったのはGA−Trisのペアだと思います。ただ、ここに投稿する前にYahooで検索したところ、GAとTrisバッファーを組み合わせているプロトコルを発見してしまい、混乱してここに投稿いたしました。 >>TrisがDEPCを壊してしまうからかと思います。（あるいは逆だったかも) >DEPCの作用は、一級アミン　R-NH2をアシル化することです。タンパク質は持つアミノ基がアシル化されて不活性化されるし、核酸のもつアミノ基も同様なのでDEPC処理のあとは加熱して加水分解しておく必要があります。 Trisはまさにアミノ基が緩衝作用を担うので、DEPC処理してはいかんのです。 　これも最初に習った当初はDEPCがTrisを壊すと覚えていたのですが、TrisがDEPCを壊すという人も周りにいたりして、自分の中で解決していないままでした。やはり、原理をいちどきっちり確認するということは重要ですね。 >これもTrisではないでしょうか。アルデヒドは一級アミンをイミンに変えて、それを介して結合します。Trisは緩衝能がなくなるし、アルデヒドは消費されてしまうでしょう。 　やはり、私が求めていたのはTrisだと思います。ただ、固定液はPFA（パラホルムアルデヒド)やホルマリン（ホルムアルデヒド)が主成分で、固定をさらに強くしたいときにGAを少々足すという感じかと思います。そうだとすると、GA-Tris以前にPFA−Trisを禁忌として覚えておくほうがずっと合理的な感じがします。ひょっとしたら、GA単体だけを用いる（PFAと組み合わせない)実験というものが実はよくあるのか、はたまた、なぜかPFAはTrisと組み合わせられるのか（やっている人を見たことはないですが)・・・。 　ともかくも、疑問を解決していただいてありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2888-3 - 2010/07/15 (木) 14:21:01 - 名無し protein Aビーズに抗体を共有結合させるときなどにジメチルピメリミデート(DMP)などの架橋剤が昔から良く使用されています。これらは２つの蛋白質の間をリジン残基などのe-アミノ基との反応を介して繋げるので、アミノ基をもつフリーの分子が共存すると競合的に妨害されてしまいます。ゆえに、反応液のbufferの選択ではTris bufferなどは避けるように書かれています。

(無題) 削除/引用 No.2888-2 - 2010/07/15 (木) 11:00:49 - AP >TrisがDEPCを壊してしまうからかと思います。（あるいは逆だったかも) DEPCの作用は、一級アミン　R-NH2をアシル化することです。タンパク質は持つアミノ基がアシル化されて不活性化されるし、核酸のもつアミノ基も同様なのでDEPC処理のあとは加熱して加水分解しておく必要があります。 Trisはまさにアミノ基が緩衝作用を担うので、DEPC処理してはいかんのです。 >これともうひとつ頭の中に古くから覚えていたペアがあるのですが、それを半分忘れてしまいました。 これもTrisではないでしょうか。アルデヒドは一級アミンをイミンに変えて、それを介して結合します。Trisは緩衝能がなくなるし、アルデヒドは消費されてしまうでしょう。

試薬の食い合わせ 削除/引用 No.2888-1 - 2010/07/14 (水) 23:35:37 - 通りすがり 　ちょっと突然に、実験の基本的なことで思い出せないことがあり、気になってしまいました。 　生物学実験のごくごく一般的な試薬の中に、組み合わせることが禁忌のペアがいといろとあると思います。たとえば、TrisバッファーをRNaseフリーにしたくても、DEPC処理をすることはできないですよね。TrisがDEPCを壊してしまうからかと思います。（あるいは逆だったかも) 　これともうひとつ頭の中に古くから覚えていたペアがあるのですが、それを半分忘れてしまいました。その片方は固定液のグルタールアルデヒド（GA)です。しかし相方が何かを忘れてしまいました。GAは固定液なので、組み合わせられないものは無数にあるとは思います。ただ、これを覚えていたときに、上記のTris-DEPCのペアと記憶の中で関連させていたので、TrisかDEPCだったかなと思ったのですが、ネットで検索してもそういう記述が見つかりません。TrisやDEPCでなくてもかなり一般的で、ご存知の方は少なくない試薬のはずなのですが。 　Yahoo知恵袋的な使い方をしてしまいすみません。もしこれじゃないかと思いつく方がいたら教えていただけますでしょうか。変な質問ですみません。

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